Piante micorrizate di carciofo: fenoli totali e attività antiossidante nei capolini

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L’attività epatoprotettiva degli estratti di carciofo è stata ripetutamente 
confermata da studi in vivo ed in vitro (Fintelmann, 1996; Dorn, 1996; 
Gebhardt, 1998; Gebhardt,  2001; Speroni et al., 2003).  
Le proprietà antiossidanti dei singoli composti, che costituiscono il complemento 
polifenolico degli estratti di carciofo sono assai diverse e quindi differente è il 
contributo delle singole molecole (acido clorogenico, acido caffeico, acido 
ferulico, ecc.), alla capacità antiossidante totale dell'estratto, così come viene 
valutato l’assorbimento e la biodisponibilità dei metaboliti degli acidi 
idrossicinnamici dopo ingestione delle parti eduli di carciofo (Wang et al., 2003; 
Azzini et al., 2007).  
Il contenuto di acido clorogenico, che è il polifenolo quantitativamente 
preponderante nelle parti eduli di carciofo, varia considerevolmente a seconda 
della varietà e dell’ambiente di coltivazione (Curadi et al., 2005). 
Tale variabilità indica la possibilità di selezionare varietà di carciofo caratterizzate 
da un contenuto potenziato di polifenoli ed una maggiore capacità antiossidante. 
Il carciofo ⎯ come molte altre specie coltivate ⎯ è in grado di formare micorrize 
arbuscolari (AM), particolari simbiosi mutualistiche tra alcuni funghi presenti nel 
terreno e le radici delle piante.  
La simbiosi micorrizica ha la capacità di ridurre i danni ossidativi causati da stress 
ambientali, come la carenza idrica e l'eccesso di sali, tramite meccanismi enzimatici 
(superossido dismutasi, catalasi, perossidasi) e non enzimatici (acido ascorbico), 
che difendono la pianta dall'accumulo di specie reattive dell'ossigeno. Sebbene 
all’inizio degli anni ’90 siano iniziate le prime ricerche sui cambiamenti metabolici 
 5
indotti dalla simbiosi con funghi AM nelle piante coltivate (Palma et al., 1993; 
Arines et al., 1994; Giovannetti e Avio, 2002), allo stato attuale sono scarse le 
informazioni relative alle interazioni fra AM e carciofo e l’influenza della simbiosi 
sulla fisiologia del metabolismo secondario della pianta.  
I progressi nella tecnica di micropropagazione hanno interessato anche la 
coltivazione del carciofo; durante gli anni ‘80 sono state messe a punto 
metodologie di moltiplicazione in vitro (Ancora, 1986;  Morone-Fortunato e 
Tagarelli, 1989). 
L’inoculazione con funghi AM di carciofo micropropagato (Morone-Fortunato e 
Ruta, 2003; Ruta et al., 2004; Morone-Fortunato et al., 2005; Morone et al., 2006), 
ha mostrato che la simbiosi micorrizica, oltre a ridurre lo stress da trapianto, 
determina un più rapido sviluppo delle piantine, conferendo maggiore resistenza 
agli attacchi patogeni e maggiore assorbimento di acqua e di elementi minerali 
(Giovannetti, 1990; Fortuna et al., 1992; Gribaudo et al., 1996). 
Anche il materiale comunemente usato per la propagazione vegetativa del carciofo 
(carducci), può essere inoculato in fase di radicazione (Gianinazzi-Pearson, 1996; 
Giovannetti e Avio, 2002).  
Allo stato attuale, i dati disponibili in letteratura suggeriscono che l'impiego 
parallelo di biotecnologie ecocompatibili, quali la micropropagazione e la 
micorrizazione, possano migliorare la filiera produttiva del carciofo per ottenere 
piante altamente produttive, dotate di elevate proprietà antiossidanti.  
 6
Effettivamente il miglioramento qualitativo tradizionale appare più accessibile nei 
confronti di alimenti di origine vegetale, rispetto a tecniche innovative come la 
modificazione genetica. 
A tal fine, sono necessarie informazioni sulla variabilità del contenuto polifenolico 
nelle parti eduli, sui modelli di accumulo degli antiossidanti durante il ciclo, e 
sull’influenza delle condizioni ambientali e colturali. Tra queste ultime, l’impiego 
di funghi micorrizici rappresenta una valida metodologia innovativa. È noto in 
letteratura l’effetto positivo svolto dalle micorrize sullo sviluppo delle piante, 
dovuto al miglior assorbimento di elementi minerali dal terreno. Più recentemente, 
le ricerche sui cambiamenti metabolici associati alla micorrizazione hanno 
evidenziato, nelle piante micorrizate, un incremento dell’attività di alcuni enzimi 
antiradicalici e della sintesi di composti antiossidanti (Porcel et al., 2003; Walter et 
al., 2000; Fester et al., 2002a/b).  
Lo scopo della presente tesi è stato quello di indagare l’influenza dell’associazione 
micorrizica, utilizzando ceppi fungini diversi, sul complemento di sostanze 
fenoliche e sull’attività antiossidante degli estratti delle parti eduli dei capolini di 
carciofo. A tal fine è stata effettuata la quantificazione dei composti fenolici totali 
(TPC) e la determinazione della capacità antiossidante (ARP) negli estratti di 
carciofo della varietà tardiva “Terom”, ottenuti da piante micorrizate con Glomus 
mosseae (Nicolson et Gerdemann), Gerdemann et Trappe, e Glomus intraradices  
(Schenck et Smith), (figura 1e 2).  
 
 

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1. I POLIFENOLI 
 
1.1 Varietà strutturali e funzione dei polifenoli  
Una sostanza fenolica è un composto chimico caratterizzato da almeno un anello 
aromatico (C
6
) con uno o più gruppi idrossilici (OH). 
Molte sostanze fenoliche derivano da reazioni di condensazioni o addizioni. 
La maggior parte delle sostanze fenoliche conosciute, (con più di 8000 varianti 
strutturali), sono di origine vegetale. In tabella 1 sono riportate le principali classi 
strutturali dei polifenoli. 
Tre vie biosintetiche possono condurre alla formazione dei polifenoli nelle piante: 
1) la via dello scichimato (che conduce attraverso la fenilalanina ammonio-liasi 
(PAL) alla maggior parte dei polifenoli vegetali, ossia i fenilpropanoidi, C
6
-
C
3
); 
2) la via dell’acetato/malonato (che conduce ad alcuni chinoni ma anche ai 
flavonoidi); 
3) la via dell’acetato/mevalonato (che porta alla formazione di terpenoidi 
aromatici e monoterpeni). 
L’enzima chiave della ramificazione tra il metabolismo primario della via dello 
scichimato e il metabolismo secondario fenilpropanoide è la PAL (Friedman, 
1987). 
 9
La via dello scichimato si trova in batteri, virus e piante e converte il 
fosfoenolpiruvato (PEP) e l’eritrosio-4-P ad acido corismico, precursore dei tre 
amminoacidi aromatici triptofano, tirosina e fenilalanina. 
Per azione della PAL, dalla fenilalanina si origina l’acido cinnamico (Fig. 5, 
Hermann, 1995).  
La prima e la seconda via biosintetica sono le più importanti nella biosintesi dei 
polifenoli (Tab.1 e fig. 3). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 10
 
Tabella 1:  principali classi strutturali dei polifenoli nelle piante (da Buchanan et al., 2000). 
 
N° di C Scheletro di atomi di C Classe di composti Esempi di composti 
6 C
6
Fenoli semplici Idrochinone, Catecolo
7 C
6
-C
1
 Idrossibenzoati 4-Idrossibenzoato 
8 C
6
-C
2
Acetofenoni, fenilacetati 4-Idrossifenilacetato
9 C
6
-C
3
Idrossicinnamati,
Cumarine 
Acido caffeico, acido 
clorogenico 
10 C
6
-C
4
 Naftochinoni Juglone
13 C
6
-C
1
-C
6
Xantoni 1,3,6,7-Idrossixantone 
14 C
6
-C
2
-C
6
Stilbeni Resveratrolo 
15 C
6
-C
3
-C
6
 Flavonoidi Quercetina
18 (C
6
-C
3
)
2
Lignani Pinoresinolo
n (C
6
-C
3
)n Lignine Lignine Gimnosperme  
e Angiosperme 
n (C
6
-C
3
-C
6
)
n
 Tannini condensati Polimeri di catechine 
 
I polifenoli sono metaboliti secondari di grande importanza biologica; essi sono 
parte integrante delle strutture delle pareti cellulari, soprattutto in forma di 
materiale polimerico (lignine e suberine) con funzione di supporto meccanico e di 
barriera contro l’invasione microbica. 
Le lignine sono, dopo la cellulosa, le più abbondanti strutture organiche sulla Terra. 
I polifenoli sono anche di ampia rilevanza ecologica: la più significativa funzione 
dei flavonoidi, soprattutto le antocianine, è il loro contributo alla colorazione dei 
fiori e dei frutti. Le sostanze fenoliche si accumulano in conseguenza di stress 
biotici ed abiotici, tra i quali gli attacchi da patogeni e gli stress da ferite: in 
generale la riparazione delle ferite richiede lignina e suberina, e la difesa dai 
patogeni è associata alla sintesi di composti fenolici antimicrobici. 
 11
Inoltre i polifenoli proteggono le piante contro i predatori (semplici acidi fenolici o 
complessi tannini, sono effettivi deterrenti); le sostanze fenoliche possono 
accumularsi come composti a basso peso molecolare, chiamati fitoalessine, in 
conseguenza all’attacco microbico. 
Le sostanze fenoliche possono influenzare la competizione tra le piante, un 
fenomeno chiamato allelopatia (ad esempio terpenoidi volatili, idrochinoni, 
idrossibenzoati ed idrossicinnamati). 
Un’altra classe di polifenoli, i flavonoidi, possono funzionare come molecole 
segnale, cioè come sostanze di riconoscimento nell’interazione simbiotica tra i 
batteri azotofissatori e certe leguminose (Strack,  1997; Dey e Harborne, 1997). 
 
1.2 Il metabolismo fenilpropanoide 
La maggior parte dei polifenoli vegetali derivano dallo scheletro fenilpropanoide 
(C
6
-C
3
) e del fenilpropanoide acetato (C
6
-C
3
-C
6
). La biosintesi dei composti 
fenolici deriva dalla via dell’acido scichimico, che controlla la produzione degli 
amminoacidi aromatici fenilalanina e tirosina, i quali vengono deamminati 
rispettivamente dagli enzimi fenilalanina ammonio-liasi (PAL) e tirosina ammonio-
liasi (TAL) producendo acido trans-cinnamico e acido p-idrossicinnamico, che 
sono le unità di base dei polifenoli. 
La PAL è l’enzima più studiato del metabolismo secondario; in alcune piante essa è 
codificata da un singolo gene, mentre in altre da una famiglia genica. 
 12
La maggior parte delle reazioni enzimatiche del metabolismo fenilpropanoide 
comprendono idrossilazioni aromatiche, metilazioni, legame con il CoA e riduzioni 
NADPH-dipendenti (Strack, 1997). 
Nella figura 3 viene riportato uno schema del metabolismo fenilpropanoide che 
conduce alla produzione dei monolignoli (alcoli p-cumarilico, coniferilico e 
sinapilico) e alle altre principali classi di polifenoli vegetali (stilbeni, cumarine, 
flavonoidi, lignine e lignani). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PAL
TAL
Metabolismo
Fenilpropanoide:
conduce alla formazione 
dei monolignoli e 
alle altre classi 
dei polifenoli.
1) Enzima PAL
2) Enzima TAL
 
 
 
Fig. 3: metabolismo fenilpropanoide (da Buchanan et al., 2000, modificato). 
 
 
 
 
 
 13
 14
1.3 I Flavonoidi 
La loro struttura è quella dei difenilpropani (C
6
-C
3
-C
6
) e consiste di due anelli 
aromatici legati attraverso tre carboni che generalmente formano un eterociclo 
ossigenato. Variazioni strutturali negli anelli permettono di suddividere i flavonoidi 
in diverse famiglie: flavonoli, flavoni, flavanoli, isoflavoni, antocianine ed altri. 
Possono avvenire modificazioni a vari livelli, si possono avere idrossilazioni, 
metilazioni, isoprenilazioni, dimerizzazione e glicosilazione (producendo O-
glicosidi o C-glicosidi). I flavonoidi costituiscono una delle classi di composti più 
caratteristiche nelle piante superiori. Molti flavonoidi sono facilmente riconoscibili 
come pigmenti floreali nella maggior parte delle angiosperme. D'altro canto la loro 
distribuzione non è limitata ai fiori ma include tutte le parti della pianta, in 
particolare frutti e foglie. Il loro nome deriva da flavus (giallo) e si riferisce al ruolo 
che giocano come pigmenti vegetali; oltre alle loro importanti funzioni legate alle 
strategie riproduttive delle piante, i flavonoidi sono particolarmente utili all’uomo 
sia per i loro impieghi in medicina che per i loro effetti sull’ecosistema agricolo 
(Maffei, 1998).  
I flavonoidi esercitano infatti un ruolo importante nella formazione delle 
associazioni simbiontiche sia micorriziche che azoto-fissatrici, interagendo 
direttamente con la nutrizione azotata e fosforica delle piante. Inoltre, i flavonoidi 
assorbono fortemente la radiazione ultravioletta e il loro accumulo nell’epidermide 
delle foglie ne suggerisce una funzione specifica di protezione dal danno che queste 
radiazioni causano al DNA delle cellule. 
 15
Le virtù salutari del vino sono imputabili in buona parte alla presenza di flavonoidi 
quali catechine, quercetina, antocianine e proantocianidine oligomeriche (OPC, 
Oligomeric ProanthoCyanidins),  il cui contenuto nell’uva varia con la specie,  con 
il grado di maturazione e con la zona di produzione oltre che essere influenzato 
dalle condizioni ambientali come l’intensità luminosa e la temperatura. Le 
catechine sono flavan-3-oli con attività biologiche multiple comprendenti effetti 
vasodilatatori, antitumorali, antinfiammatori, antibatterici e di stimolazione del 
sistema immunitario. La quercetina è un flavonoide la cui attività antiossidante si 
concretizza nell’inibizione della lipoperossidazione. Le antocianine sono 
localizzate nella buccia degli acini dell’uva come monomeri glicosilati. Le 
proantocianidine oligomeriche sono formate da un numero variabile di unità 
flavaniche, in particolare da catechine e da epicatechine; nei semi di uva rossa sono 
per lo piú presenti OPC esterificate con acido gallico. Le OPC sono un esempio 
unico di antiossidanti biologicamente attivi, testati sia farmacologicamente che 
clinicamente, con indicazione specifica di prevenzione e di terapia nelle malattie 
cardiovascolari. Interessante risulta la capacità delle OPC di aumentare 
nell’organismo i livelli di antiossidanti quali la vitamina C e il ruolo di modulatrici 
del sistema immunitario (Strack, 1997; Buchanan et al., 2000). 
 
 
 
 
 
 16
1.4 Gli Stilbeni 
Il resveratrolo appartiene alla famiglia degli stilbeni (C
6
-C
2
-C
6
), composti fenolici a 
basso peso molecolare, formati da due anelli benzenici separati da un etano o da un 
ponte etenico e sintetizzati dalla pianta in risposta all’attacco di funghi, che 
agiscono come regolatori di crescita. 
Nella vite, il resveratrolo si accumula principalmente nella buccia degli acini (50-
100 µg/g di buccia); durante la fase di macerazione, passa dalle bucce al mosto ed è 
per questo maggiormente contenuto nei vini rossi.  
Tra i numerosi effetti biologici del resveratrolo, è opportuno menzionare 
l’inibizione della perossidazione lipidica, l’attività di radical scavenging, l’attività 
antinfiammatoria, l’attività antitumorale e l’attività vasorilassante (Saiko et al., 
2007; Bertelli, 2007). Inoltre questo composto ha dimostrato un’azione 
antiteratogena e di fludificazione del sangue che può limitare l'insorgenza di 
placche trombotiche (Gu et al., 1999).   
 
1.5 Le Lignine e i Lignani 
I monolignoli sono convertiti in due distinte classi dei metaboliti delle piante: le 
lignine e i lignani (Fig. 3). 
Le lignine costituiscono un gruppo di polimeri eterogenei del fenilpropano delle 
piante, dove formano i costituenti delle pareti cellulari (Maffei, 1998). I costituenti 
monomerici delle lignine sono tre alcool idrossicinnamici (monolignoli): alcool 4-
cumarilico, alcool coniferilico e sinapilico (Strack, 1997; Maffei, 1998). 
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Nonostante i 50 anni di ricerca sulla lignina, rimangono ancora dubbi sull’esatto 
meccanismo di polimerizzazione. Nuove tecniche di indagine strutturale, come la 
risonanza magnetica nucleare, danno valore all’ipotesi che la polimerizzazione non 
sia un processo casuale, ma organizzato (Maffei, 1998). 
I lignani sono dimeri dell’alcool cinnamico, che attraverso ulteriori ciclizzazioni e 
modificazioni portano alla formazione di una vasta gamma di strutture molecolari. 
Sebbene essi siano sottostrutture delle lignine, non esiste correlazione evidente che 
siano diretti precursori delle lignine. Infatti essi rappresentano una classe distinta di 
composti fenolici. 
I lignani sono ampiamente distribuiti nelle piante, accumulati come componenti 
solubili, alcuni di essi vengono accumulati come glicosidi, i quali posseggono 
marcata e riconosciuta attività biologica (Maffei, 1998). 
 
1.6 I Tannini 
Sono composti fenolici con un’elevata affinità per le proteine; l’elevata massa 
molecolare rende i tannini capaci di legarsi con le proteine e di formare con esse 
composti insolubili. 
I gruppi più significativi sono: i tannini idrolizzabili, i tannini condensati 
(procianidine e proantocianidine) ed i tannoidi. 
La tipica struttura dei tannini idrolizzabili (i gallotannini ed ellagitannini), è 
caratterizzata da una parte centrale poliidrossilata costituita da un ß-D-
glucopiranosio. I gallotannini sono esteri dell’acido gallico.