2
Al di là dell’interesse puramente ecologico, in altri studi sugli inusuali
composti da invertebrati bentonici sono state valutate le potenzialità
applicative in ambito farmacologico. Ciò ha portato alla registrazione di un
elevato numero di brevetti per applicazioni industriali.
4
Tra i metaboliti più attivi è da ricordare il composto briostatina 1,
5
isolato dal briozoo Bugula neritina, in avanzata fase di studio presso il
National Cancer Institute per l’uso nel trattamento di melanomi, linfomi non-
Hodgkin’s e cancro renale.
Briostatina 1
O
O
O
O
O
O
H
OH
H
O
O
H
H
OH
H
H
H
HO
O
O
O
O
OHH
H
O
3
Il pentapeptide lineare dolastatina 10,
6
trovato nel mollusco
opistobranco Dolabella auricolaria, è invece candidato per curare varie
patologie, tra cui il cancro del fegato e la leucemia.
Dolastatina 10
Dal gruppo dei tunicati, di cui fa parte l’organismo studiato in questo
lavoro di tesi sperimentale, sono stati isolati oligopeptidi ciclici con attività
antitumorale (dall’ascidia Lissoclinum patella) ed una nuova classe di
depsipeptidi, le didemnine (da ascidie della famiglia Didemnidae), con
elevata attività antivirale oltre che antitumorale. I composti deidrodidemnina
B (isolata dal tunicato mediterraneo Aplidium albicans)
7
ed ecteinascidina-
743 (da un tunicato caraibico)
8
sono in fase II di studio negli Stati Uniti,
Canada ed in Europa per le loro proprietà antitumorali.
8,9
N
H
N
O
H
O
H
N
H
H
H
N
O
H
H
H
N
S
N
O
HH
O
O
4
Deidrodidemnina B
Per la presenza di corda dorsale (almeno nella fase larvale), i tunicati
sono inquadrati ad un elevato livello evolutivo tra gli animali invertebrati. Il
phylum Cordata, di cui fa parte il subphylum Tunicata (=Urochordata),
comprende anche i subphyla Cephalochordata (=Acrania) e Vertebrata.
Il subphylum Tunicata viene suddiviso in tre classi:
a) Appendicularia - tunicati fusiformi planctonici, mai coloniali,
provvisti di coda e corda anche nello stadio adulto.
b) Thaliacea - tunicati liberamente natanti, coloniali e con corpo a
forma di botticella. La corda è presente solo nella larva.
c) Ascidiacea - tunicati con forme solitarie, riunite in gruppi o in
colonie costituite da molti esemplari. Creano formazioni bulbose, incrostanti
N
O
O
O
N
NH
O
O
NHO
OOH
O
O
ONH
N
N
O
OO
O
5
o a grappolo. La fase adulta è sempre sessile e la corda dorsale è presente solo
nella fase larvale.
Mentre per gli Ascidiacei, bentonici e sessili, sono state descritte
strategie di difesa chimica, per le due classi planctoniche (Appendicularia e
Thaliacea) non sono stati riscontrati analoghi meccanismi difensivi.
10
Questo lavoro di tesi sperimentale è stato svolto presso l’Istituto per la
Chimica di Molecole di Interesse Biologico del CNR, nell’ambito della
tematica “Studi chimici dell’ecologia di invertebrati bentonici marini”
11-13
ed
ha avuto come obiettivo l’isolamento, la caratterizzazione strutturale e la
valutazione dell’attività biologica dei metaboliti secondari di un’ascidia
coloniale di difficile determinazione, raccolta lungo le coste settentrionali
della Spagna.
Il tunicato, sul quale sono in corso studi tassonomici, sembra appartenere
alla famiglia Polyclinidae (probabilmente al genere Aplidium). In vivo le
colonie presentano un gambo allungato ed una colorazione giallastra.
6
2. Isolamento e purificazione dei metaboliti secondari.
L’ascidia studiata è stata raccolta lungo la costa atlantica della Spagna
settentrionale a Vigo (Galizia) durante il mese di Agosto del 1999, congelata
immediatamente e trasferita presso l’ICMIB.
Il campione congelato è stato immerso in acetone, pestato e sottoposto
a sonicazione in un bagnetto ad ultrasuoni, allo scopo di ottenere una
estrazione più efficace (Schema 1).
-Sonicazione in bagnetto ultrasonico con acetone
-Estrazione tradizionale con acetone
-Evaporazione del solvente organico
-Diluizione del residuo con acqua distillata
-Estrazione con etere etilico
Residuo acquoso
n-BuOH
Residuo acquoso
-Colonna di silice in gradiente di
etere di petrolio/etere etilico
Schema 1 : Estrazione e purificazione dei metaboliti liposolubili
dell'ascidia.
Campione congelato di ascidia
Estratto etereo
(1.38 g)
Estratto butanolico
(0.60 g)
DEFBCAGHI
7
L’estrazione in acetone è stata ripetuta più volte. Gli estratti cosi
ottenuti sono stati combinati ed evaporati sotto pressione ridotta fino a
completo allontanamento del solvente organico. Il residuo acquoso risultante
è stato diluito con acqua distillata ed estratto prima con etere etilico e
successivamente con n-butanolo, al fine di separare i composti liposolubili
meno polari da quelli più polari. Sono stati ottenuti in questo modo un estratto
etereo di 1.38 g ed un estratto butanolico di 0.60 g.
Uno screening cromatografico preliminare dei due estratti, utilizzando
differenti sistemi eluenti, ha evidenziato la presenza di una serie metaboliti
UV-visibili nell’estratto etereo
Eluente: etere di petrolio - etere etilico 1:1
Estratto etereo grezzo Estratto etereo grezzo
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1
Rf
Composti 1+2
Composti 3+4
Acidi grassi
Steroli
Composti 5+6
Eluente: etere di petrolio
Composto 2
Composto 1
8
(Rf 0.7 e Rf 0.25 etere di petrolio/etere etilico 1:1; Rf 0.2 e Rf 0.3, etere di
petrolio), mentre l’estratto butanolico non è risultato particolarmente
interessante.
L’estratto etereo è stato quindi frazionato mediante cromatografia su
colonna di silice a cielo aperto, utilizzando come eluente etere di petrolio con
quantità crescenti di etere etilico. Le frazioni raccolte sono state riunite nei
seguenti raggruppamenti:
• raggruppamento (A 42.1 mg, contenente i composti 1+2)
• raggruppamento (B 490.4 mg)
• raggruppamento (C 188.1 mg)
• raggruppamento (D 20.1 mg, contenente i composti 3+4)
• raggruppamento (E 18.4 mg)
• raggruppamento (F 150.9 mg)
• raggruppamento (G 26.6 mg, contenente i composti 5+6)
• raggruppamento (H 24.3 mg)
• raggruppamento (I 114 mg).
Un preliminare esame degli spettri protonici (
1
H-NMR) dei
raggruppamenti A, D e G ha immediatamente mostrato che si trattava di
miscele più o meno complesse di prodotti correlati ed ha anche evidenziato
9
una stretta relazione strutturale tra i metaboliti contenuti nei differenti
raggruppamenti.
I raggruppamenti B, E ed F si sono rilevati essere costituiti rispettivamente
dai comuni trigliceridi e steroli, mentre i raggruppamenti C, H, ed I
contenevano miscele di lipidi complessi non identificati.
Si è proceduto allora alla separazione dei diversi componenti dei
raggruppamenti: A, D e G.
Un’aliquota della frazione A (10 mg) è stata purificata mediante
cromatografia su strato sottile preparativa, utilizzando come eluente n-esano.
Le due bande UV-visibili, ad Rf 0.25 (A1) e ad Rf 0.15 (A2), sono state
grattate via ed eluite con etere etilico.
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1
Rf
Eluente: n-esano
A 2
A 1
R a g g r u p p a m e n t o A
10
Gli spettri
1
H-NMR delle frazioni A1 (0.4 mg) e A2 (1.5 mg) hanno
indicato che si trattava di due composti puri, tra loro correlati, a cui sono state
assegnate le strutture 1 e 2, rispettivamente.
1
2
11
Il raggruppamento D è stato purificato mediante cromatografia liquida
ad alta performance (HPLC) a fase inversa, utilizzando una colonna Novapak
C-18, eluita con una miscela di metanolo/acqua, nel rapporto 7:3.
Il cromatogramma ottenuto è riportato in figura 2. Gli spettri
1
H-NMR
delle frazioni corrispondenti ai picchi D1 (3.5 mg), D2 (4.1 mg), D3 (2.3 mg),
D4 (8 mg) hanno indicato che si trattava di composti correlati strutturalmente.
Ai composti corrispondenti ai picchi D1 e D2 sono state assegnate
rispettivamente le strutture 3 e 4, mentre D3 e D4 sono risultate essere
miscele complesse.
-20000
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
1
3
6
7
7
3
2
1
0
9
7
1
4
6
2
1
8
2
8
2
1
9
3
2
5
5
8
2
9
2
3
3
2
8
9
3
6
5
4
4
0
1
9
4
3
8
4
4
7
5
0
5
1
1
5
5
4
8
0
5
8
4
5
6
2
1
1
6
5
7
6
6
9
4
1
7
3
0
6
tempo
a
s
s
o
r
b
a
n
z
a
↑ ↑ ↑ ↑
D1 D2 D3 D4
Figura 2. - Cromatogramma HPLC del raggruppamento D.
12
OH
3
OH
4
Il raggruppamento G è stato purificato mediante HPLC a fase inversa
utilizzando una colonna Novapack C-18, eluita con una miscela
metanolo/acqua nel rapporto 7:3.
Il cromatogramma ottenuto è riportato in figura 3. Gli spettri
1
H-NMR
delle frazioni corrispondenti ai picchi G1 (2.0 mg) e G2 (4.1 mg) hanno
indicato che si trattava di composti puri relazionati tra loro ed a cui sono state
assegnate rispettivamente le strutture 5 e 6.
13
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
1 3 5 7 9
1
1
1
3
1
5
1
7
1
9
2
1
2
3
2
5
2
7
2
9
3
1
3
3
3
5
3
7
3
9
4
1
4
3
4
5
4
7
4
9
5
1
5
3
5
5
5
7
5
9
6
1
6
3
6
5
tempo
a
s
s
o
r
b
a
n
z
a
↑ ↑
G1 G2
Figura 3. - Cromatogramma HPLC del raggruppamento G.
OH
OH
5
OH
OH
6
14
3. Determinazione strutturale dei composti 1-6.
La struttura dei sei composti incogniti, che si sono rivelati essere nuovi
metaboliti, purificati come descritto precedentemente, è stata determinata
utilizzando tecniche spettroscopiche ed essenzialmente la spettroscopia di
Risonanza Magnetica Nucleare (NMR). Notevoli difficoltà sono state
incontrate nella raccolta dei dati spettrali di queste molecole, in quanto esse
sono risultate molto instabili.
Si è reso perciò necessario purificare ripetutamente i prodotti, allo
scopo di avere campioni preparati di fresco. La difficoltà di mantenere i
campioni stabili in soluzione per registrare spettri NMR che richiedevano un
tempo maggiore di acquisizione ha impedito di ottenere, per alcuni metaboliti
isolati, una completa caratterizzazione strutturale.
L’esame degli spettri NMR protonici e di carbonio dei composti 1-6 ha
innanzitutto indicato la presenza in tutte queste molecole di una struttura
lipidica a catena lineare contenente una serie di doppi e tripli legami. Infatti,
tutti gli spettri protonici sono caratterizzati da una serie di segnali a δ 5.0-6.5,
attribuibili a protoni olefinici, a δ 2.4-1.9, attribuibili a metileni allilici, a δ
1.4-1.2 attribuibili a metileni in catena alifatica e da tipici segnali singoletti a
δ 2.5-3.1, attribuibili a protoni acetilenici terminali.
15
Tentativi di registrare spettri di massa dei composti 1-6 con le tecniche
EIMS e FAB sono risultati infruttuosi, a causa della estrema reattività delle
molecole che ha impedito l’ottenimento dello ione molecolare e di una
frammentazione razionalizzabile.
Buoni risultati si sono avuti utilizzando la spettrometria di massa con
sorgente ad ionizzazione chimica. In particolare, i raggruppamenti D e G,
contenenti rispettivamente i composti 3-4 e 5-6, sono stati sottoposti a
cromatografia liquida ad alta pressione accoppiata alla spettrometria di massa
ad ionizzazione chimica come rivelatore (LCMS). Nelle figure seguenti sono
riportati i cromatogrammi LC e i corrispondenti cromatogrammi MS dei
raggruppamenti D e G (Fig .4 e Fig.5).
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