Nuovi analoghi del Cambinol come inibitori delle Sirtuine: sintesi e valutazione biologica

 6 
come risultato di modifiche strutturali a livello cromatinico locale. Il silenziamento 
trascrizionale è associato alla ipoacetilazione istonica HDAC-mediata, mentre più aree 
trascrizionalmente attive del genoma coinvolgono reazioni di acetilazione istonica HAT-
catalizzate su gruppi ε-amminici di code lisiniche del core istonico. 
Negli eucarioti sono state identificate tre classi di deacetilasi: classe I, classe II e 
classe III in accordo alla loro omologia con le deacetilasi istoniche di Saccharomyces 
Cerevisiae: RPD3 (Reduced Potassium Dependency 3) (HDAC 1-3, 8, 11,  classe I), 
HDA1 (Histone DeAcetylase) (HDAC4-7, 9, 10, classe II), Sir2 (SIRT1-7 (sirtuine), 
classe III). 
Le HDAC di classe I sono essenzialmente delle proteine nucleari e sono espresse 
nella maggior parte dei tessuti e linee cellulari. 
Le HDAC di classe II sono regolate dalla compartimentalizzazione tra nucleo e 
citoplasma attraverso fosforilazione reversibile, mostrano una espressione tessuto 
specifica e sono suddivise in due sottoclassi: II a (HDAC4, -5, -7, -9) e II b (HDAC6 e 
HDAC10), in base alla loro omologia di sequenza e organizzazione di dominio. 
Le classi I e II mostrano una significativa somiglianza per quanto riguarda il proprio 
core catalitico, ed hanno un meccanismo Zn
+2
 dipendente di deacetilazione, che permette 
loro di generare acetato libero e la proteina deacetilata. Entrambe queste classi sono 
inibite dalla tricostatina A (TSA) e da altri inibitori HDAC naturali e sintetici, la 
maggior parte dei quali non è in grado di distinguere tra HDAC di classe I e quelle di 
classe II. 
Le HDAC di classe III contengono un dominio catalitico di 275 aminoacidi 
conservati non correlato a quello delle altre due classi e mostrano un meccanismo 
 7 
deacetilasico NAD
+
-dipendente, il cui risultato corrisponde alla formazione di una 
molecola di O-acetil-ADP ribosio insieme ad un residuo lisinico libero.
11-12
 
Tali deacetilasi non sono inibite da TSA. Esse vengono comunemente chiamate 
sirtuine ed il composto più importante di questa famiglia è Silent Information Regulator 
2 (Sir2) coinvolto nel silenziamento genico, nella stabilità cromosomica e 
nell’invecchiamento. 
Sir2 di S. cerevisiae  agisce nella repressione trascrizionale a livello telomerico, del 
DNA ribosomiale e di loci accoppiati silenti, come anche nella regolazione della durata 
della vita in risposta ad una restrizione calorica. Sir2 è anche implicata nel processo di 
riparazione di danni sul DNA, nella progressione del ciclo cellulare e nella stabilità 
cromosomica nel lievito.
13-14
 
2. Struttura della cromatina 
L’acetilazione e la deacetilazione post-traduzionali reversibili del core istonico del 
nucleosoma sono fondamentali per l’assemblaggio della cromatina e per la regolazione 
della trascrizione genica.
4,15-16 
Nelle cellule eucariotiche il DNA nucleare si trova associato a diversi gruppi di 
proteine a formare un ammasso di fibre di cromatina che nel complesso rappresentano 
l’intero contenuto del nucleo. Le fibre di cromatina contengono due classi principali di 
proteine: la prima è costituita dalle proteine eterogenee o non istoniche mentre la 
seconda da un gruppo di proteine basiche chiamate istoni. 
Gli istoni sono piccole proteine basiche in cui arginina e lisina rappresentano circa 
un quarto dei residui amminoacidici totali; essi risultano costituiti da un dominio 
globulare e da una regione ammino-terminale o istone tail (coda istonica), che esce dal 
 8 
nucleosoma e ha una struttura flessibile. L’elevato contenuto di tali residui basici 
conferisce agli istoni una forte carica positiva nelle condizioni di PH intracellulare. 
 
 
Figura 1. Struttura del nucleosoma: H2A giallo, H2B rosso, H3 blu, H4 verde. 
 
Gli istoni vengono distinti in cinque tipi principali, denominati H1, H2A, H2B, H3 
e H4. La cromatina contiene quantità equivalenti di molecole di H2A, H2B, H3, H4 e un 
numero pari a circa la metà di molecole di istoni H1. Queste proporzioni sono 
estremamente costanti in tutte le cellule eucariotiche, indipendentemente dal tipo di 
cellula e dal loro stato fisiologico. 
Sebbene non sia ancora chiaro come l’istone H1 partecipi alla creazione di strutture 
più compatte, sicuramente questo svolge un ruolo fondamentale nel determinare il livello 
di condensazione del DNA stabilizzando il folding attraverso la neutralizzazione 
elettrostatica dei segmenti di DNA linker, per mezzo del dominio carbossi-terminale 
carico positivamente. 
 9 
 
Figura 2. (a) Il nucleosoma costituito dagli istoni H2A, H2B, H3 e H4 presenti ognuno due volte in 
modo da formare un ottamero, intorno al quale si avvolge il DNA. (b) Sono mostrate le catene N-
terminali delle proteine istoniche. Le lisine (K) sono potenziali siti di modifiche covalenti (A, acetile; 
C, estremità carbossi-terminale; E, acido glutammico; M, metile; N, estremità ammino-terminale; P, 
fosfato; S, serina; Ub, ubiquitina). 
 
Le proteine non istoniche, come già accennato, sono un gruppo di molecole molto 
eterogenee e tendono a presentarsi con notevole variabilità in cellule differenti. Molte 
proteine non istoniche sono enzimi; alcuni di questi, come la DNA polimerasi e l’RNA 
polimerasi, utilizzano il DNA come substrato, altri modificano le proteine come le 
acetilasi che catalizzano le modificazioni delle proteine della cromatina. 
Delle proteine non istoniche fanno parte anche proteine strutturali, regolatrici e 
quelle che costituiscono l’impalcatura strutturale dei cromosomi ed i fattori di 
trascrizione che regolano la trascrizione genica. 
L’unità fondamentale della struttura cromatinica è il nucleosoma. Ogni nucleosoma 
contiene 146 pb di DNA strettamente associate ad una particella definita core e costituita 
da un ottametro di istoni comprendente 2 copie ciascuna di H2A, H2B, H3 e H4. 
I nucleosomi non si legano casualmente al DNA ma il loro core istonico tende a 
localizzarsi in posizioni ricche di appaiamenti adenina-timina, in cui la scanalatura 
 10 
minore dell’elica del DNA viene a contatto con il centro del nucleosoma rendendolo più 
compatto di circa sette volte. 
Tuttavia la compattazione completa del DNA in un cromosoma è diecimila volte 
più grande, infatti gli stessi nucleosomi appaiono ulteriormente organizzati in una 
struttura a spirale detta solenoide. Tale struttura contiene 6 nucleosomi per ciascun giro 
che, a sua volta, necessita della presenza di un complesso proteico H1. Le fibre di 30 nm 
forniscono una compattezza al DNA di circa cento volte, ma sembra che alcune regioni 
del DNA si associno per mezzo di un’ulteriore impalcatura nucleare. 
In questo modo, la struttura altamente ordinata dei nucleosomi definisce livelli 
distinti di organizzazione cromatinica e anche l’attività genica. 
Il core istonico è soggetto ad una serie di modificazioni post-traduzionali, 
catalizzate da enzimi, quali l’acetilazione, la fosforilazione, la metilazione, 
l’ubiquitinazione e l’ADP-ribosilazione. Di queste, l’acetilazione è la più studiata.
17
 
Lo stato di acetilazione del core istonico è controllato dall’attività di due famiglie di 
enzimi, l’istone acetiltransferasi (HAT) e l’istone deacetilasi (HDAC).
7,18
 I gruppi ε-
amminici dei residui di lisina nelle regioni N-terminali degli istoni sono i substrati per 
HAT ed HDAC. I geni trascrizionalmente attivi sono associati a istoni  super-acetilati 
mentre la repressione trascrizionale è associata a bassi livelli di acetilazione istonica. 
All’interno del nucleosoma gli istoni carichi positivamente ipoacetilati sono 
strettamente legati alla struttura del DNA attraverso l’interazione elettrostatica con i 
gruppi fosfato, mantenendo la cromatina in uno stato trascrizionalmente silente. 
L’acetilazione neutralizza la carica positiva sugli istoni, destabilizzando la sovrastruttura 
cromatinica altamente ordinata, favorendo, in questo modo, il probabile accesso dei 
 11 
fattori di trascrizione, dei complessi di regolazione trascrizionale e dell’RNA-polimerasi 
alle regioni promotrici del DNA. 
La deacetilazione degli istoni ristabilisce la carica positiva sui residui di lisina del 
core istonico, permettendo alla cromatina di tornare nella sua conformazione 
superavvolta e compatta, silente dal punto di vista trascrizionale.
5-6,19 
In generale, quindi, la cromatina (closed chromatin o eterocromatina) media la 
repressione trascrizionale, mentre della cromatina aperta (open chromatin o 
eucromatina) fanno parte i geni trascrizionalmente attivi.
20
 
 
 
Figura 3. Eterocromatina (cromatina condensate) e Eucromatina (cromatina aperta). 
 
3. Metilazione istonica 
La constatazione che gli istoni H3 e H4 sono altamente metilati e presentano un 
basso tasso di turnover dei gruppi metilici ha portato a credere che la metilazione 
istonica sia una modifica generica e statica. Tuttavia, insieme all’acetilazione, la 
metilazione rappresenta un processo dinamico coinvolto nella regolazione trascrizionale, 
nella condensazione cromatinica e nell’assemblaggio dell’eterocromatina. Ci sono due 
tipi di metilazione operate da metilasi istoniche (HMT), che presentano come target 
 12 
rispettivamente arginina e lisina. Tali metilasi appartengono alla famiglia 
CARM1/PRMT1 e svolgono la loro azione  soprattutto a livello degli istoni H3 e H4. 
Ad esempio la metilazione della lisina 4 dell’istone H3  è correlata all’attivazione 
genica,  mentre la metilazione della lisina 9 (substrato anche per l’acetilazione) e della 
lisina 27 dello stesso istone sono coinvolte nella repressione trascrizionale. 
4. Fosforilazione istonica 
La fosforilazione della serina 10 dell’istone H3 è un’importante modifica sia 
nell’attivazione trascrizionale che nella condensazione cromosomica durante la mitosi. 
Tuttavia, considerando che questi due processi dovrebbero portare a modificazioni 
opposte della struttura cromatinica (closed chromatin durante la mitosi, open chromatin 
durante la trascrizione), si è giunti all’ipotesi che la fosforilazione porti alla creazione di 
una nuova superficie di binding  piuttosto che ad alterazioni della struttura cromatinica. 
5. Ubiquitinazione istonica 
Di notevole importanza è l’ubiquitinazione istonica; ad esempio, in S. cerevisiae,  la 
lisina 123 all’interno della coda carbossi-terminale dell’istone H2B è un substrato per la 
Rad6 ubiquitina ligasi. Questa modifica risulta critica per la crescita mitotica e meiotica, 
sebbene non sia chiaro se direttamente coinvolta nella trascrizione. Inoltre, TafII250 
(subunità del fattore di trascrizione TFIID) ha dimostrato possedere attività di 
ubiquitinazione per l’istone H1 aggiungendo questa attività a quelle chinasica e 
acetiltransferasica che risultano coinvolte nella trascrizione. 
 13 
6. Acetilazione e deacetilazione istoniche 
Come già anticipato, l’acetilazione, tra tutte le modificazioni, è sicuramente la più 
studiata. Lo stato di acetilazione del core istonico è controllato dall’attività di due 
superfamiglie di enzimi: la famiglia dell’istone acetiltransferasi (HAT) e la famiglia 
dell’istone deacetilasi (HDAC).
7,18
 
 
 
Figura 4. Reazione catalizzata dall’istone acetiltransferasi e dall’istone deacetilasi. 
 
Gli ε-ammino gruppi dei residui di lisina nelle regioni ammino-terminali degli istoni 
sono i substrati per HAT e HDAC. 
Generalmente i geni trascrizionalmente attivi sono associati a istoni altamente 
acetilati mentre la repressione trascrizionale è associata a bassi livelli di acetilazione 
istonica. All’interno del nucleosoma istoni ipoacetilati, carichi positivamente, sono 
strettamente legati al backbone del DNA attraverso l’interazione elettrostatica con i 
gruppi fosfato, mantenendo la cromatina in uno stato trascrizionalmente silente. 
L’acetilazione neutralizza la carica positiva sugli istoni, destabilizzando le sovrastrutture 
cromatiniche e favorendo l’accesso dei fattori di trascrizione, dei complessi regolatori e 
della RNA polimerasi alle regioni promotrici del DNA. 
 14 
La deacetilazione istonica ristabilisce la carica positiva sui residui di lisina degli 
istoni del core, permettendo nuovamente alla cromatina di tornare nella sua struttura 
superavvolta e compatta.
6,19,21
 
6.1 L’istone acetiltransferasi 
Una relazione tra acetilazione istonica e attivazione trascrizionale fu proposta per la 
prima volta 30 anni fa
22
 ma solo recentemente è stato scoperto il meccanismo 
molecolare alla base di questo processo. Le HAT sono proteine co-attivatrici della 
trascrizione, distinte in almeno 4 famiglie nelle cellule dei mammiferi; tali proteine  non 
legano direttamente il DNA ma lavorano in complessi multiproteici che possono 
includere altre HAT, co-attivatori trascrizionali e co-repressori, e che presentano come 
target  anche proteine non istoniche.
23-24
 
L’acetilazione catalizzata da HAT avviene prefenzialmente su specifiche lisine 
istoniche: ad esempio, nell’istone H3, di molte specie, i principali siti di acetilazione 
sono rappresentati dalle lisine 9, 14, 18 e 23. 
Sulla base della struttura primaria, le proteine HAT sono divise in superfamiglie che 
spesso mostrano anche specificità di substrato. 
La famiglia CBP/p300 consiste in due co-attivatori trascrizionali altamente 
omologhi che sono espressi in modo ubiquitario e giocano un ruolo decisivo nella 
crescita cellulare, nella differenziazione e nell’apoptosi. 
Alla famiglia GNAT appartengono proteine che interagiscono con p300/CBP, 
partecipando alla formazione di complessi ad attività istone-acetiltrasferasica simili ed 
essendo così coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare. 
 15 
Il fattore di trascrizione E2F, favorendo l’espressione di determinati geni, induce 
l’entrata nella fase S; l’acetilazione di E2F da parte di PCAF porta ad un aumento 
dell’attività trascrizionale di E2F in vivo. Al contrario p53 agisce come proteina tumor-
suppressor attraverso l’inibizione della progressione del ciclo cellulare e dell’entrata in 
fase S. L’acetilazione di p53 da parte di PCAF o p300/CBP aumenta la sua capacità di 
legame al DNA. PCAF risulta così coinvolto in due opposti processi cellulari: può 
promuovere la progressione del ciclo cellulare attraverso l’attivazione di E2F o può 
portare all’arresto del ciclo cellulare con l’attivazione di p53. Mutazioni nelle regioni 
che controllano l’attività HAT o la specificità di legame di PCAF possono dunque avere 
effetti significativi sulla proliferazione cellulare e sulla cancerogenesi. 
La famiglia MYST contiene un sito di legame per l’acetil-CoA (motivo condiviso 
con le altre HAT) preceduto da un atipico zinc finger. Appartengono a questa famiglia 
HAT quali MOZ, MORF, HBO1 e Tip60. In molte forme leucemiche la regione 
ammino-terminale di MOZ, contenente il dominio MYST, risulta fusa con la porzione 
C- terminale, contenente il dominio HAT, di acetiltransferasi quali CBP oppure con il 
fattore di trascrizione TIF2 che è in grado di interagire con CBP con conseguente 
alterazione dell’attività acetiltrasferasica. 
I Nuclear Receptors Co-activators, recettori nucleari e proteine co-attivatrici, sono 
in grado di stimolare l’espressione genica facilitando l’assemblaggio dei fattori di 
trascrizione in uno stabile complesso di pre-iniziazione. L’attività istone-
acetiltransferasica può essere uno dei meccanismi attraverso cui questi fattori di 
trascrizione ottengono l’accesso alla cromatina trascrizionalmente silente. 
 
 16 
6.2 L’istone deacetilasi 
Finora sono state identificate 18 deacetilasi di mammifero e queste possono essere 
suddivise in due famiglie: la famiglia dell’istone deacetilasi propriamente dette (HDAC) 
e la famiglia di deacetilasi ySir2-like o sirtuine (anche definite HDAC di classe III). 
I componenti della famiglia HDAC possono essere suddivisi sulla base della loro 
struttura primaria, della grandezza e della somiglianza con le deacetilasi di 
Saccharomyces cerevisiae in due classi: quelli omologhi del regolatore trascrizionale 
RPD3 di lievito o classe I (HDAC1, 2, 3, 8, 11) e gli omologhi di HDA1 o classe II 
(HDAC 4, 5, 6, 7, 9, 10).
24-26
 
Inoltre, sulla base dell’omologia tra i domini deacetilasici, la classe II può essere 
ulteriormente suddivisa in due sottoclassi chiamate II a (HDAC4, 5, 7 e 9) e II b 
(HDAC6, che contiene come caratteristica peculiare due domini deacetilasici omologhi, 
e HDAC10, più simile a HDAC6 che ad HDAC4-7 e HDAC9). 
Tutti questi enzimi (famiglia HDAC) possiedono un dominio catalitico altamente 
conservato di approssimativamente 390 aminoacidi e deacetilano il loro substrato con lo 
stesso meccanismo Zn
2+ 
dipendente. Le proteine di classe II sono due o tre volte più 
grandi rispetto alla proteine di classe I (120-130 kDa e 42-55 kDa rispettivamente) e 
sembrano possedere sequenze conservate nel dominio catalitico che differiscono 
nell’ambito delle due classi.
27 
Recentemente è stato identificato un nuovo composto della famiglia HDAC: 
HDAC11 che, sebbene risulti più vicino alla classe I, non è stato ancora classificato visto 
che l’omologia dell’intera sequenza risulta troppo bassa. 
 17 
Come la classe I, i componenti della classe II funzionano in complessi 
multienzimatici in vivo e sono sensibili all’inibizione da parte di TSA, SAHA e relativi 
composti ad attività inibitoria. 
Comunque la classe II sembra interagire con complessi proteici differenti: ad 
esempio interagisce con uno o più fattori di trascrizione quali MEF2, BCL6, PLZF e 
TR2; con co-repressori trascrizionali come N-CoR, SMRT, B-CoR e CtBP e con la 
proteina legante la metil-lisina HP1.
28-29
 
Tra queste interazioni la più studiata è quella con MEF2 (Myocite Enhancer Factor 
2). HDAC di classe II a inibiscono la trascrizione MEF2 dipendente e regolano la 
biogenesi in modelli di differenziazione muscolare in vitro.
28,30
 
Al contrario degli HDAC di classe I che sono essenzialmente enzimi nucleari 
(l’unica eccezione è HDAC3),  gli enzimi di classe II sono localizzati sia nel nucleo che 
nel citoplasma in funzione del loro stato di fosforilazione e del successivo legame con 
proteine 14-3-3. 
Per quanto riguarda la famiglia delle sirtuine, S. cerevisiae ne presenta cinque: Sir2 
e quattro omologhi, Hst1-4 (homologue of sir two). Nell’uomo sono state identificate 7 
sirtuine (SIRT1-7). La famiglia delle sirtuine può essere divisa in 5 classi sulla base 
della struttura primaria. Tutte le cinque sirtuine di lievito sono proteine di classe I come 
la sirtuina umana SIRT3. SIRT4 è in classe II, SIRT5 in classe III, e SIRT6 e SIRT7 in 
classe IV. Queste deacetilasi contengono un dominio catalitico altamente conservato di 
275 aminoacidi che non risulta collegato a quello delle HDAC di classe I e classe II, 
inoltre operano con un meccanismo NAD
+
-dipendente. 
 18 
Nonostante queste differenze sia strutturali che meccanicistiche le proteine di 
entrambe le famiglie hanno mostrato di poter silenziare la trascrizione a livello di 
specifici promotori o domini cromosomici. Finora le funzioni cellulari assegnate alla 
sola SIRT1 umana rivelano la capacità di deacetilare p53 nella porzione carbossi-
terminale e di inibire l’attivazione trascrizionale  e l’apoptosi mediata da p53.
31-32
 La 
loro localizzazione sub-cellulare non è stata ancora chiarita ma sembra che alcune di 
esse siano prevalentemente nucleari mentre altre citoplasmatiche.
33-34 
 19 
 
CAPITOLO 2 
 
1. Scoperta ed identificazione di Sir2 
Studi condotti sul lievito e su Drosophila hanno portato alla scoperta di fattori 
cellulari, che sono richiesti per il silenziamento trascrizionale; tra questi le proteine 
codificate da geni SIR di lievito, responsabili del silenziamento a livello di sequenze 
ripetute di DNA, quali: loci accoppiati, telomeri e rDNA. 
Sir2 (Silent Information Regulator Two) è il prototipo delle proteine HDAC di 
classe III, comunemente chiamate sirtuine. Tali enzimi sono altamente conservati dai 
procarioti agli eucarioti, con sette (SIRT1-SIRT7) e cinque (Sir2 e Hst1-4) omologhi 
Sir2 rispettivamente nell’uomo e nel lievito. 
Nel lievito, la proteina Sir2 funziona nella regolazione trascrizionale, nella 
progressione del ciclo cellulare, nei processi di riparazione di danni sul DNA e 
nell’invecchiamento. 
Geni SIR2, SIR3 e SIR4 sono richiesti per il silenziamento a livello di loci 
accoppiati
35
 e telomeri
36
, mentre soltanto SIR2 è richiesto per il silenziamento sull’ 
rDNA.
37-38 
Il silenziamento genico determina una struttura cromatinica più compatta e 
inaccessibile a livello locale di fattori di trascrizione, come asserito da indagini di 
accessibilità al DNA.
39-40
 In accordo con la deacetilazione globale di istoni di lievito 
osservata quando Sir2 è sovraespressa
41
, quest’ultima viene quindi considerata un’istone 
deacetilasi.