6
come risultato di modifiche strutturali a livello cromatinico locale. Il silenziamento
trascrizionale è associato alla ipoacetilazione istonica HDAC-mediata, mentre più aree
trascrizionalmente attive del genoma coinvolgono reazioni di acetilazione istonica HAT-
catalizzate su gruppi ε-amminici di code lisiniche del core istonico.
Negli eucarioti sono state identificate tre classi di deacetilasi: classe I, classe II e
classe III in accordo alla loro omologia con le deacetilasi istoniche di Saccharomyces
Cerevisiae: RPD3 (Reduced Potassium Dependency 3) (HDAC 1-3, 8, 11, classe I),
HDA1 (Histone DeAcetylase) (HDAC4-7, 9, 10, classe II), Sir2 (SIRT1-7 (sirtuine),
classe III).
Le HDAC di classe I sono essenzialmente delle proteine nucleari e sono espresse
nella maggior parte dei tessuti e linee cellulari.
Le HDAC di classe II sono regolate dalla compartimentalizzazione tra nucleo e
citoplasma attraverso fosforilazione reversibile, mostrano una espressione tessuto
specifica e sono suddivise in due sottoclassi: II a (HDAC4, -5, -7, -9) e II b (HDAC6 e
HDAC10), in base alla loro omologia di sequenza e organizzazione di dominio.
Le classi I e II mostrano una significativa somiglianza per quanto riguarda il proprio
core catalitico, ed hanno un meccanismo Zn
+2
dipendente di deacetilazione, che permette
loro di generare acetato libero e la proteina deacetilata. Entrambe queste classi sono
inibite dalla tricostatina A (TSA) e da altri inibitori HDAC naturali e sintetici, la
maggior parte dei quali non è in grado di distinguere tra HDAC di classe I e quelle di
classe II.
Le HDAC di classe III contengono un dominio catalitico di 275 aminoacidi
conservati non correlato a quello delle altre due classi e mostrano un meccanismo
7
deacetilasico NAD
+
-dipendente, il cui risultato corrisponde alla formazione di una
molecola di O-acetil-ADP ribosio insieme ad un residuo lisinico libero.
11-12
Tali deacetilasi non sono inibite da TSA. Esse vengono comunemente chiamate
sirtuine ed il composto più importante di questa famiglia è Silent Information Regulator
2 (Sir2) coinvolto nel silenziamento genico, nella stabilità cromosomica e
nell’invecchiamento.
Sir2 di S. cerevisiae agisce nella repressione trascrizionale a livello telomerico, del
DNA ribosomiale e di loci accoppiati silenti, come anche nella regolazione della durata
della vita in risposta ad una restrizione calorica. Sir2 è anche implicata nel processo di
riparazione di danni sul DNA, nella progressione del ciclo cellulare e nella stabilità
cromosomica nel lievito.
13-14
2. Struttura della cromatina
L’acetilazione e la deacetilazione post-traduzionali reversibili del core istonico del
nucleosoma sono fondamentali per l’assemblaggio della cromatina e per la regolazione
della trascrizione genica.
4,15-16
Nelle cellule eucariotiche il DNA nucleare si trova associato a diversi gruppi di
proteine a formare un ammasso di fibre di cromatina che nel complesso rappresentano
l’intero contenuto del nucleo. Le fibre di cromatina contengono due classi principali di
proteine: la prima è costituita dalle proteine eterogenee o non istoniche mentre la
seconda da un gruppo di proteine basiche chiamate istoni.
Gli istoni sono piccole proteine basiche in cui arginina e lisina rappresentano circa
un quarto dei residui amminoacidici totali; essi risultano costituiti da un dominio
globulare e da una regione ammino-terminale o istone tail (coda istonica), che esce dal
8
nucleosoma e ha una struttura flessibile. L’elevato contenuto di tali residui basici
conferisce agli istoni una forte carica positiva nelle condizioni di PH intracellulare.
Figura 1. Struttura del nucleosoma: H2A giallo, H2B rosso, H3 blu, H4 verde.
Gli istoni vengono distinti in cinque tipi principali, denominati H1, H2A, H2B, H3
e H4. La cromatina contiene quantità equivalenti di molecole di H2A, H2B, H3, H4 e un
numero pari a circa la metà di molecole di istoni H1. Queste proporzioni sono
estremamente costanti in tutte le cellule eucariotiche, indipendentemente dal tipo di
cellula e dal loro stato fisiologico.
Sebbene non sia ancora chiaro come l’istone H1 partecipi alla creazione di strutture
più compatte, sicuramente questo svolge un ruolo fondamentale nel determinare il livello
di condensazione del DNA stabilizzando il folding attraverso la neutralizzazione
elettrostatica dei segmenti di DNA linker, per mezzo del dominio carbossi-terminale
carico positivamente.
9
Figura 2. (a) Il nucleosoma costituito dagli istoni H2A, H2B, H3 e H4 presenti ognuno due volte in
modo da formare un ottamero, intorno al quale si avvolge il DNA. (b) Sono mostrate le catene N-
terminali delle proteine istoniche. Le lisine (K) sono potenziali siti di modifiche covalenti (A, acetile;
C, estremità carbossi-terminale; E, acido glutammico; M, metile; N, estremità ammino-terminale; P,
fosfato; S, serina; Ub, ubiquitina).
Le proteine non istoniche, come già accennato, sono un gruppo di molecole molto
eterogenee e tendono a presentarsi con notevole variabilità in cellule differenti. Molte
proteine non istoniche sono enzimi; alcuni di questi, come la DNA polimerasi e l’RNA
polimerasi, utilizzano il DNA come substrato, altri modificano le proteine come le
acetilasi che catalizzano le modificazioni delle proteine della cromatina.
Delle proteine non istoniche fanno parte anche proteine strutturali, regolatrici e
quelle che costituiscono l’impalcatura strutturale dei cromosomi ed i fattori di
trascrizione che regolano la trascrizione genica.
L’unità fondamentale della struttura cromatinica è il nucleosoma. Ogni nucleosoma
contiene 146 pb di DNA strettamente associate ad una particella definita core e costituita
da un ottametro di istoni comprendente 2 copie ciascuna di H2A, H2B, H3 e H4.
I nucleosomi non si legano casualmente al DNA ma il loro core istonico tende a
localizzarsi in posizioni ricche di appaiamenti adenina-timina, in cui la scanalatura
10
minore dell’elica del DNA viene a contatto con il centro del nucleosoma rendendolo più
compatto di circa sette volte.
Tuttavia la compattazione completa del DNA in un cromosoma è diecimila volte
più grande, infatti gli stessi nucleosomi appaiono ulteriormente organizzati in una
struttura a spirale detta solenoide. Tale struttura contiene 6 nucleosomi per ciascun giro
che, a sua volta, necessita della presenza di un complesso proteico H1. Le fibre di 30 nm
forniscono una compattezza al DNA di circa cento volte, ma sembra che alcune regioni
del DNA si associno per mezzo di un’ulteriore impalcatura nucleare.
In questo modo, la struttura altamente ordinata dei nucleosomi definisce livelli
distinti di organizzazione cromatinica e anche l’attività genica.
Il core istonico è soggetto ad una serie di modificazioni post-traduzionali,
catalizzate da enzimi, quali l’acetilazione, la fosforilazione, la metilazione,
l’ubiquitinazione e l’ADP-ribosilazione. Di queste, l’acetilazione è la più studiata.
17
Lo stato di acetilazione del core istonico è controllato dall’attività di due famiglie di
enzimi, l’istone acetiltransferasi (HAT) e l’istone deacetilasi (HDAC).
7,18
I gruppi ε-
amminici dei residui di lisina nelle regioni N-terminali degli istoni sono i substrati per
HAT ed HDAC. I geni trascrizionalmente attivi sono associati a istoni super-acetilati
mentre la repressione trascrizionale è associata a bassi livelli di acetilazione istonica.
All’interno del nucleosoma gli istoni carichi positivamente ipoacetilati sono
strettamente legati alla struttura del DNA attraverso l’interazione elettrostatica con i
gruppi fosfato, mantenendo la cromatina in uno stato trascrizionalmente silente.
L’acetilazione neutralizza la carica positiva sugli istoni, destabilizzando la sovrastruttura
cromatinica altamente ordinata, favorendo, in questo modo, il probabile accesso dei
11
fattori di trascrizione, dei complessi di regolazione trascrizionale e dell’RNA-polimerasi
alle regioni promotrici del DNA.
La deacetilazione degli istoni ristabilisce la carica positiva sui residui di lisina del
core istonico, permettendo alla cromatina di tornare nella sua conformazione
superavvolta e compatta, silente dal punto di vista trascrizionale.
5-6,19
In generale, quindi, la cromatina (closed chromatin o eterocromatina) media la
repressione trascrizionale, mentre della cromatina aperta (open chromatin o
eucromatina) fanno parte i geni trascrizionalmente attivi.
20
Figura 3. Eterocromatina (cromatina condensate) e Eucromatina (cromatina aperta).
3. Metilazione istonica
La constatazione che gli istoni H3 e H4 sono altamente metilati e presentano un
basso tasso di turnover dei gruppi metilici ha portato a credere che la metilazione
istonica sia una modifica generica e statica. Tuttavia, insieme all’acetilazione, la
metilazione rappresenta un processo dinamico coinvolto nella regolazione trascrizionale,
nella condensazione cromatinica e nell’assemblaggio dell’eterocromatina. Ci sono due
tipi di metilazione operate da metilasi istoniche (HMT), che presentano come target
12
rispettivamente arginina e lisina. Tali metilasi appartengono alla famiglia
CARM1/PRMT1 e svolgono la loro azione soprattutto a livello degli istoni H3 e H4.
Ad esempio la metilazione della lisina 4 dell’istone H3 è correlata all’attivazione
genica, mentre la metilazione della lisina 9 (substrato anche per l’acetilazione) e della
lisina 27 dello stesso istone sono coinvolte nella repressione trascrizionale.
4. Fosforilazione istonica
La fosforilazione della serina 10 dell’istone H3 è un’importante modifica sia
nell’attivazione trascrizionale che nella condensazione cromosomica durante la mitosi.
Tuttavia, considerando che questi due processi dovrebbero portare a modificazioni
opposte della struttura cromatinica (closed chromatin durante la mitosi, open chromatin
durante la trascrizione), si è giunti all’ipotesi che la fosforilazione porti alla creazione di
una nuova superficie di binding piuttosto che ad alterazioni della struttura cromatinica.
5. Ubiquitinazione istonica
Di notevole importanza è l’ubiquitinazione istonica; ad esempio, in S. cerevisiae, la
lisina 123 all’interno della coda carbossi-terminale dell’istone H2B è un substrato per la
Rad6 ubiquitina ligasi. Questa modifica risulta critica per la crescita mitotica e meiotica,
sebbene non sia chiaro se direttamente coinvolta nella trascrizione. Inoltre, TafII250
(subunità del fattore di trascrizione TFIID) ha dimostrato possedere attività di
ubiquitinazione per l’istone H1 aggiungendo questa attività a quelle chinasica e
acetiltransferasica che risultano coinvolte nella trascrizione.
13
6. Acetilazione e deacetilazione istoniche
Come già anticipato, l’acetilazione, tra tutte le modificazioni, è sicuramente la più
studiata. Lo stato di acetilazione del core istonico è controllato dall’attività di due
superfamiglie di enzimi: la famiglia dell’istone acetiltransferasi (HAT) e la famiglia
dell’istone deacetilasi (HDAC).
7,18
Figura 4. Reazione catalizzata dall’istone acetiltransferasi e dall’istone deacetilasi.
Gli ε-ammino gruppi dei residui di lisina nelle regioni ammino-terminali degli istoni
sono i substrati per HAT e HDAC.
Generalmente i geni trascrizionalmente attivi sono associati a istoni altamente
acetilati mentre la repressione trascrizionale è associata a bassi livelli di acetilazione
istonica. All’interno del nucleosoma istoni ipoacetilati, carichi positivamente, sono
strettamente legati al backbone del DNA attraverso l’interazione elettrostatica con i
gruppi fosfato, mantenendo la cromatina in uno stato trascrizionalmente silente.
L’acetilazione neutralizza la carica positiva sugli istoni, destabilizzando le sovrastrutture
cromatiniche e favorendo l’accesso dei fattori di trascrizione, dei complessi regolatori e
della RNA polimerasi alle regioni promotrici del DNA.
14
La deacetilazione istonica ristabilisce la carica positiva sui residui di lisina degli
istoni del core, permettendo nuovamente alla cromatina di tornare nella sua struttura
superavvolta e compatta.
6,19,21
6.1 L’istone acetiltransferasi
Una relazione tra acetilazione istonica e attivazione trascrizionale fu proposta per la
prima volta 30 anni fa
22
ma solo recentemente è stato scoperto il meccanismo
molecolare alla base di questo processo. Le HAT sono proteine co-attivatrici della
trascrizione, distinte in almeno 4 famiglie nelle cellule dei mammiferi; tali proteine non
legano direttamente il DNA ma lavorano in complessi multiproteici che possono
includere altre HAT, co-attivatori trascrizionali e co-repressori, e che presentano come
target anche proteine non istoniche.
23-24
L’acetilazione catalizzata da HAT avviene prefenzialmente su specifiche lisine
istoniche: ad esempio, nell’istone H3, di molte specie, i principali siti di acetilazione
sono rappresentati dalle lisine 9, 14, 18 e 23.
Sulla base della struttura primaria, le proteine HAT sono divise in superfamiglie che
spesso mostrano anche specificità di substrato.
La famiglia CBP/p300 consiste in due co-attivatori trascrizionali altamente
omologhi che sono espressi in modo ubiquitario e giocano un ruolo decisivo nella
crescita cellulare, nella differenziazione e nell’apoptosi.
Alla famiglia GNAT appartengono proteine che interagiscono con p300/CBP,
partecipando alla formazione di complessi ad attività istone-acetiltrasferasica simili ed
essendo così coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare.
15
Il fattore di trascrizione E2F, favorendo l’espressione di determinati geni, induce
l’entrata nella fase S; l’acetilazione di E2F da parte di PCAF porta ad un aumento
dell’attività trascrizionale di E2F in vivo. Al contrario p53 agisce come proteina tumor-
suppressor attraverso l’inibizione della progressione del ciclo cellulare e dell’entrata in
fase S. L’acetilazione di p53 da parte di PCAF o p300/CBP aumenta la sua capacità di
legame al DNA. PCAF risulta così coinvolto in due opposti processi cellulari: può
promuovere la progressione del ciclo cellulare attraverso l’attivazione di E2F o può
portare all’arresto del ciclo cellulare con l’attivazione di p53. Mutazioni nelle regioni
che controllano l’attività HAT o la specificità di legame di PCAF possono dunque avere
effetti significativi sulla proliferazione cellulare e sulla cancerogenesi.
La famiglia MYST contiene un sito di legame per l’acetil-CoA (motivo condiviso
con le altre HAT) preceduto da un atipico zinc finger. Appartengono a questa famiglia
HAT quali MOZ, MORF, HBO1 e Tip60. In molte forme leucemiche la regione
ammino-terminale di MOZ, contenente il dominio MYST, risulta fusa con la porzione
C- terminale, contenente il dominio HAT, di acetiltransferasi quali CBP oppure con il
fattore di trascrizione TIF2 che è in grado di interagire con CBP con conseguente
alterazione dell’attività acetiltrasferasica.
I Nuclear Receptors Co-activators, recettori nucleari e proteine co-attivatrici, sono
in grado di stimolare l’espressione genica facilitando l’assemblaggio dei fattori di
trascrizione in uno stabile complesso di pre-iniziazione. L’attività istone-
acetiltransferasica può essere uno dei meccanismi attraverso cui questi fattori di
trascrizione ottengono l’accesso alla cromatina trascrizionalmente silente.
16
6.2 L’istone deacetilasi
Finora sono state identificate 18 deacetilasi di mammifero e queste possono essere
suddivise in due famiglie: la famiglia dell’istone deacetilasi propriamente dette (HDAC)
e la famiglia di deacetilasi ySir2-like o sirtuine (anche definite HDAC di classe III).
I componenti della famiglia HDAC possono essere suddivisi sulla base della loro
struttura primaria, della grandezza e della somiglianza con le deacetilasi di
Saccharomyces cerevisiae in due classi: quelli omologhi del regolatore trascrizionale
RPD3 di lievito o classe I (HDAC1, 2, 3, 8, 11) e gli omologhi di HDA1 o classe II
(HDAC 4, 5, 6, 7, 9, 10).
24-26
Inoltre, sulla base dell’omologia tra i domini deacetilasici, la classe II può essere
ulteriormente suddivisa in due sottoclassi chiamate II a (HDAC4, 5, 7 e 9) e II b
(HDAC6, che contiene come caratteristica peculiare due domini deacetilasici omologhi,
e HDAC10, più simile a HDAC6 che ad HDAC4-7 e HDAC9).
Tutti questi enzimi (famiglia HDAC) possiedono un dominio catalitico altamente
conservato di approssimativamente 390 aminoacidi e deacetilano il loro substrato con lo
stesso meccanismo Zn
2+
dipendente. Le proteine di classe II sono due o tre volte più
grandi rispetto alla proteine di classe I (120-130 kDa e 42-55 kDa rispettivamente) e
sembrano possedere sequenze conservate nel dominio catalitico che differiscono
nell’ambito delle due classi.
27
Recentemente è stato identificato un nuovo composto della famiglia HDAC:
HDAC11 che, sebbene risulti più vicino alla classe I, non è stato ancora classificato visto
che l’omologia dell’intera sequenza risulta troppo bassa.
17
Come la classe I, i componenti della classe II funzionano in complessi
multienzimatici in vivo e sono sensibili all’inibizione da parte di TSA, SAHA e relativi
composti ad attività inibitoria.
Comunque la classe II sembra interagire con complessi proteici differenti: ad
esempio interagisce con uno o più fattori di trascrizione quali MEF2, BCL6, PLZF e
TR2; con co-repressori trascrizionali come N-CoR, SMRT, B-CoR e CtBP e con la
proteina legante la metil-lisina HP1.
28-29
Tra queste interazioni la più studiata è quella con MEF2 (Myocite Enhancer Factor
2). HDAC di classe II a inibiscono la trascrizione MEF2 dipendente e regolano la
biogenesi in modelli di differenziazione muscolare in vitro.
28,30
Al contrario degli HDAC di classe I che sono essenzialmente enzimi nucleari
(l’unica eccezione è HDAC3), gli enzimi di classe II sono localizzati sia nel nucleo che
nel citoplasma in funzione del loro stato di fosforilazione e del successivo legame con
proteine 14-3-3.
Per quanto riguarda la famiglia delle sirtuine, S. cerevisiae ne presenta cinque: Sir2
e quattro omologhi, Hst1-4 (homologue of sir two). Nell’uomo sono state identificate 7
sirtuine (SIRT1-7). La famiglia delle sirtuine può essere divisa in 5 classi sulla base
della struttura primaria. Tutte le cinque sirtuine di lievito sono proteine di classe I come
la sirtuina umana SIRT3. SIRT4 è in classe II, SIRT5 in classe III, e SIRT6 e SIRT7 in
classe IV. Queste deacetilasi contengono un dominio catalitico altamente conservato di
275 aminoacidi che non risulta collegato a quello delle HDAC di classe I e classe II,
inoltre operano con un meccanismo NAD
+
-dipendente.
18
Nonostante queste differenze sia strutturali che meccanicistiche le proteine di
entrambe le famiglie hanno mostrato di poter silenziare la trascrizione a livello di
specifici promotori o domini cromosomici. Finora le funzioni cellulari assegnate alla
sola SIRT1 umana rivelano la capacità di deacetilare p53 nella porzione carbossi-
terminale e di inibire l’attivazione trascrizionale e l’apoptosi mediata da p53.
31-32
La
loro localizzazione sub-cellulare non è stata ancora chiarita ma sembra che alcune di
esse siano prevalentemente nucleari mentre altre citoplasmatiche.
33-34
19
CAPITOLO 2
1. Scoperta ed identificazione di Sir2
Studi condotti sul lievito e su Drosophila hanno portato alla scoperta di fattori
cellulari, che sono richiesti per il silenziamento trascrizionale; tra questi le proteine
codificate da geni SIR di lievito, responsabili del silenziamento a livello di sequenze
ripetute di DNA, quali: loci accoppiati, telomeri e rDNA.
Sir2 (Silent Information Regulator Two) è il prototipo delle proteine HDAC di
classe III, comunemente chiamate sirtuine. Tali enzimi sono altamente conservati dai
procarioti agli eucarioti, con sette (SIRT1-SIRT7) e cinque (Sir2 e Hst1-4) omologhi
Sir2 rispettivamente nell’uomo e nel lievito.
Nel lievito, la proteina Sir2 funziona nella regolazione trascrizionale, nella
progressione del ciclo cellulare, nei processi di riparazione di danni sul DNA e
nell’invecchiamento.
Geni SIR2, SIR3 e SIR4 sono richiesti per il silenziamento a livello di loci
accoppiati
35
e telomeri
36
, mentre soltanto SIR2 è richiesto per il silenziamento sull’
rDNA.
37-38
Il silenziamento genico determina una struttura cromatinica più compatta e
inaccessibile a livello locale di fattori di trascrizione, come asserito da indagini di
accessibilità al DNA.
39-40
In accordo con la deacetilazione globale di istoni di lievito
osservata quando Sir2 è sovraespressa
41
, quest’ultima viene quindi considerata un’istone
deacetilasi.
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