Nuova strategia sintetica verso alcaloidi a scheletro berberinico, con reazione di accoppiamento tipo Suzuki

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1.1.  Telomeri e telomerasi come target antitumorali 
 
1.1.1.  Telomeri: aspetti strutturali e funzionali 
 
I telomeri sono strutture nucleoproteiche situate alle estremit  dei cromosomi lineari degli 
organismi eucariotici. Essi hanno la funzione di difendere il materiale genetico della cellula, poichØ 
evitano la degradazione dei cromosomi e assicurano la completa replicazione del genoma 
impedendo la perdita di informazione genetica. Inoltre evitano che le estremit  dei cromosomi siano 
riconosciute come siti di danneggiamento del DNA impedendo cos  processi di fusione e 
ricombinazione impropri. 
Il DNA telomerico Ł per la maggior parte presente come DNA duplex, ma presenta all estremit  3  
un certo numero di basi in eccesso rispetto al filamento complementare, dando origine ad un tratto a 
singolo filamento. La sequenza nucleotidica telomerica Ł costituita da un unit  ripetuta di 5-8 
coppie di basi, caratterizzata dalla massiccia presenza di guanine (fino a 50% sul totale delle basi). 
Essa Ł altamente conservata a livello evolutivo in tutti gli organismi eucariotici (tab. 1.1.1.a); 
nell uomo, e piø in generale nei mammiferi, tale sequenza Ł 5 -TTAGGG-3  [Moyzis et al., 1988] 
ed appare ripetuta con la sua complementare per 5-15 kbp formando il tratto di duplex, mentre il 
tratto a singolo filamento risulta formato da 130-210 basi [Makarov, 1997]. 
La lunghezza dei telomeri varia non solo tra le diverse specie di organismi eucariotici, ma anche, 
all interno della stessa specie, a seconda del tipo di cellula e della sua et , ovvero dal numero di 
divisioni mitotiche da essa subite.  
La struttura dei telomeri Ł stata a lungo oggetto di discussioni e controversie. Al giorno d oggi si 
pu  affermare con un buon margine di sicurezza che essi non assumono (come si riteneva fino a 
pochi anni fa) una conformazione lineare in cui il tratto a singolo filamento Ł esposto all ambiente 
cellulare, poichØ Ł stato dimostrato, mediante studi di  microscopia elettronica, che essi si ripiegano 
a formare due loop (fig. 1.1.1.a): il primo, detto T-loop, si origina dal ripiegamento a forcina della 
parte terminale del DNA a doppio filamento ed Ł generato a sua volta dall inserimento del tratto a 
singolo filamento nella regione duplex a formare il secondo loop, chiamato D-loop (D sta per 
displacement) [Griffith et al., 1999].  
 
 
 
 
 
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Fig. 1.1.1.a La nuova struttura proposta per le estremit  telome riche, con i due loop e le 
proteine che ne inducono la formazione. (Rezler et al. 2001) 
 
Fig. 1.1.1.b Oltre che 
stabilizzate dalla 
formazione dei loop, le 
estremit  telomeriche sono 
direttamente legate ad un 
gran numero di proteine, in 
una complessa 
organizzazione. Sono 
riportate le estremit  dei 
telomeri umani e di lievito. 
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La formazione di queste strutture Ł favorita e stabilizzata dalla presenza di proteine altamente 
conservate a livello evolutivo [Blackburn, 2001] che interagiscono col DNA telomerico in maniera 
specifica. Se ne conoscono alcune che si legano direttamente al DNA a singolo filamento allo scopo 
di proteggerlo, mentre altre, oltre che col DNA, possono associarsi  tra loro formando un complesso 
nucleoproteico di ordine superiore [Gasser, 2000; Bianchi et al., 2006; Downey et al,. 2006]  
(fig. 1.1.1.b). Ad esempio Ł noto che la proteina del lievito Rap1p oltre a legarsi al DNA telomerico 
interagisce a livello del suo dominio C-terminale con altre quattro proteine, essendo da una parte in 
contatto con Rif1p e Rif2p e contemporaneamente legata anche a Sir3p e Sir4p. 
L importanza delle proteine di legame Ł stata messa in evidenza con esperimenti su cellule di 
mammifero mediante inattivazione di TRF2, una di queste proteine DNA-specifiche [Karlseder et 
al,. 1999]. Quando questa proteina viene espressa in una forma non attiva si registra la trascrizione 
di due geni (ATM e p53), che ha come conseguenza l arresto del ciclo cellulare e quindi la 
senescenza o perfino l apoptosi. In questo caso il DNA telomerico, non essendo piø complessato 
con TRF2, non assume piø la usuale conformazione a doppio loop, ma viene riconosciuto ed 
attaccato da altre proteine coinvolte nei meccanismi di controllo e riparazione del DNA 
danneggiato, finendo degradato o legato covalentemente all estremit  di altri cromosomi [Griffith et 
al., 1999; Zhang et al., 2006]. Quindi il DNA telomerico e le proteine ad esso legate rivestono 
l importantissima funzione di sottrarre le estremit  dei cromosomi ad attivit  cellulari che ne 
mettano a rischio l integrit , proteggendoli dalla degradazione e dalla fusione con altri segmenti di 
DNA. 
Un altra funzione importante svolta dai telomeri Ł quella di impedire la perdita di materiale 
genetico durante la replicazione a causa del cosiddetto end replication problem. E  infatti noto che 
la DNA polimerasi Ł incapace di copiare le ultime basi dell estremit  3  di ogni filamento, cosicchØ  
si registra un progressivo accorciamento delle estremit  cromosomiche ad ogni divisione mitotica di 
circa 25-200 bp [Harley et al, 1990] (fig.1.1.1.c). Questo accorciamento avviene appunto a livello 
del DNA telomerico, che, non essendo codificante (Ł infatti organizzato in eterocromatina 
costitutiva), viene  sacrificato senza subire la perdita di materiale genetico, evitando l insorgere 
nelle cellule figlie di condizioni critiche per la sopravvivenza [Rezler et al., 2003].  
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Fig. 1.1.1.c   
Rappresentazione schematica del modello convenzionale per la sintesi incompleta del  lagging 
strand  e del nuovo modello proposto per  l accorci amento del telomero, che considera un attiva 
degradazione al 5 . In entrambi i modelli, la sintesi del  lagging strand  produce una serie di 
frammenti di Okazaki covalentemente legati a corti inneschi di RNA alla loro estremit  5 . La 
successiva degradazione di tali inneschi, la riparazione dei tratti mancanti e la successiva ligazione 
sostituiscono tutti gli inneschi di RNA con DNA tranne il primo, provocando un accorciamento 
dell estremit  5 . Il modello della degradazione de l filamento per l accorciamento dei telomeri 
propone che il DNA venga perso da entrambe le estremit  del cromosoma successivamente alla 
replicazione, a causa della degradazione del filamento 5 , che lascia un eccesso a singolo filamento 
al 3  ad entrambe le estremit  del cromosoma. (Maka rov et al. 1997) 
 
Tabella 1.1.1.a  
 
Sequenze ripetitive terminali 
riscontrate nei telomeri di 
diversi organismi. Le 
sequenze riportate sono state 
sequenziate, direttamente dal 
DNA genomico o in seguito 
a clonazione, oppure sono 
state ottenute analizzando le 
sequenze sintetizzate dalla 
telomerasi di quella 
particolare specie. (Kipling 
1995) 
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1.1.2.  Le strutture G-quadruplex del DNA 
 
Le strutture G-quadruplex sono state oggetto di numerosi studi da quando si Ł scoperta l esistenza 
di numerose sequenze di basi all interno del genoma di cellule eucariotiche che potenzialmente 
potrebbero assumere questa conformazione e che sono abbondanti in regioni biologicamente 
importanti. Sono state trovate numerose proteine, in grado di legare questa struttura o di 
promuoverne la formazione, la cui assenza porta a disfunzioni e ad una vasta gamma di malattie 
genetiche. Tutto ci  suggerisce che l equilibrio di  formazione e dissociazione delle strutture G-
quadruplex sia coinvolto nella regolazione di un gran numero di processi, come l espressione 
genica, la replicazione, la ricombinazione ed il mantenimento della lunghezza dei telomeri [Ghosal 
et al., 2006].   
Le strutture G-quadruplex si formano da sequenze nucleotidiche ricche di guanine. L unit  di base Ł 
una struttura ciclica generata dall associazione di quattro guanine (chiamata G-quartet o G-tetrad) 
unite tra loro mediante legami idrogeno di Hoogsteen, ovvero accoppiamenti non convenzionali in 
cui ciascuna guanina Ł legata alle sue due vicine tramite due legami idrogeno aventi una geometria 
leggermente distorta rispetto a quelli di Watson e Crick (fig. 1.1.2.a-b). 
Queste tetradi, sotto la spinta termodinamica di forze idrofobiche e di Van der Waals, possono 
impilarsi l una sull altra, dando strutture a quadr upla elica. Questo fenomeno Ł agevolato dalla 
presenza di cationi monovalenti ( in particolare Na+ e K+) che, collocandosi tra i due piani di tetradi, 
vanno a coordinare gli otto ossigeni carbonilici stabilizzando la struttura impilata [Williamson, 
1993] (fig. 1.1.2.c-d-e). L energia di stabilizzazione Ł proporzionale al grado di sovrapposizione 
delle aree aromatiche planari di ciascuna tetrade. 
Si Ł visto [Rhodes et al., 1995] che queste strutture si possono formare non solo a partire da quattro 
catene differenti (tetrameri), ma anche da due (dimeri) o da una sola catena ricca di guanine 
(momomeri). Ovviamente negli ultimi due casi Ł necessaria la formazione di loop. In tutti i casi Ł 
possibile un elevato numero di combinazioni: i quattro filamenti di DNA possono infatti essere tra 
di loro paralleli o antiparalleli (fig.1.1.2.f-g) e le guanine si possono trovare in conformazione syn o 
anti a seconda delle posizioni relative, ottenute per rotazione intorno al legame glicosidico, assunte 
dai due piani su cui giacciono la base stessa ed il desossiribosio [Williamson, 1994]. 
La conformazione di volta in volta assunta Ł risultata dipendere da diversi fattori: la concentrazione 
e la sequenza dell oligonucleotide, il tipo di catione presente e la sua concentrazione, nonchŁ 
l eventuale presenza di molecole a basso peso molecolare con in grado stabilizzare il G-tetraplex. 
L elevato numero di strutture G-qudruplex scoperte fino ad oggi sembra rispecchiare la grande 
variet  di sequenze ricche di guanine, che potenzia lmente potrebbero assumere questa  
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Fig. 1.1.2.a Struttura di una tetrade di guanine, legate tra di loro da legami 
idrogeno di Hoogsteen. (Kipling 1995) 
 
Fig. 1.1.2.b 
 
Confronto tra accoppiamento 
guanina-guanina di Hoogsteen (a) e 
accoppiamento guanina-citosina di 
Watson e Crick (b). L atomo di 
azoto segnato con un asterisco (N7) Ł 
fondamentale nell accoppiamento di 
Hoogsteen, in quanto risulta 
impegnato in un legame idrogeno nel 
primo caso e non nel secondo. 
(Kipling 1995) 
 
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Fig. 1.1.2.c  Il G-quartet Ł una struttura ciclica di quattro guanine legate da legami idrogeno. 
G-quartet possono sovrapporsi l uno sull altro a formare quad ruple eliche (a). 
Rappresentazione in prospettiva di uno ione monovalente che si lega a strutture 
G-quartet (b). Lo ione Ł legato tra due G-quartet, coordinato (linee tratteggiate) 
da otto atomi di ossigeno (cerchi piccoli bianchi) di otto guanine. (Williamson 
1993) 
 
Figura 1.1.2.d (a) G-quartet; (b) modello a riempimento del G-quartet ottenuto per diffrazione di                    
raggi-X. Al centro della struttura Ł coordinato un catione monovalente (in azzurro nel modello    a 
riempimento) 
   
(a) (b) 
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Fig. 1.1.2.f Rapresentazione schematica delle diverse possibili topologie per 
strutture G-quadruplex in forma monomerica (a) e tetramerica 
(b,c,d) (Kipling 1995)  
 
Figura 1.1.2.g Differenti polarit  delle impalcature di fosfati d ei G-quadruplex (Neidle et al. 2003) 
Figura 1.1.2.e Coordinazione dello ione K+ fra due tetradi di 
guanine.  
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conformazione, presenti nel genoma eucariotico. Di conseguenza Ł diventata un tema di grande 
attualit  la dimostrazione dell esistenza di questa  struttura in vivo.  
Studi hanno prodotto evidenti prove dell esistenza di strutture G-quadruplex in vivo nel protozoo 
Stylonychia lemnae [Schaffitzel et al., 2001; Paeschke et al.,2005]. 
 
1.1.3.  Telomerasi: possibili ruoli nella senescenza cellulare e nel cancro 
 
E  stato sperimentalmente dimostrato che cellule umane in coltura hanno una potenzialit  
replicativa limitata. Esse infatti si replicano fino al raggiungimento di un punto (limite di Hayflick), 
in cui la crescita della popolazione cellulare si arresta. In questa fase, chiamata M1, si registra un 
progressivo accorciamento dei telomeri fino ad una lunghezza che porta alla cosiddetta senescenza 
cellulare, ossia uno stato in cui le cellule non si dividono piø. L entrata in questo stadio pu  esser e 
evitata inattivando i geni umani soppressori dei tumori p53 e pRB: in queste condizioni le cellule 
ritornano in grado di replicarsi fino a che i telomeri non divengono cos  corti da provocare l entrata  
in una seconda fase critica, M2, in cui si registra un arresto della crescita della popolazione dovuto 
ad un bilanciamento tra la proliferazione e la morte cellulare. Infatti queste cellule, pur conservando 
la loro capacit  riproduttiva, possiedono dei telom eri talmente corti da innescare i meccanismi di 
riparazione del DNA danneggiato (il che si riflette in fusioni incontrollate dei cromosomi e 
ricombinazioni aberranti) che ne causano l apoptosi. Eccezionalmente alcune cellule possono 
scampare alla fase M2 e diventare immortali stabilizzando la lunghezza dei loro telomeri. Questo 
accade quasi sempre mediante l attivazione della telomerasi [White et al., 2001] (fig. 1.1.3.a). 
La telomerasi Ł un enzima ribonucleoproteico, responsabile dell aggiunta di ripetizioni telomeriche 
all estremit  3  dei cromosomi [Bryan et al., 1999]. E  composta da due subunit : la prima 
(Telomerase RNA o TR) contiene un filamento di RNA che termina con una sequenza 
complementare al DNA telomerico a singolo filamento, che le permette di legarsi all estremit  del 
telomero e di agire da stampo [Feng et al., 1995]; la seconda (TElomerase Reverse Transcriptase o 
TERT) Ł la subunit  catalitica [Nakamura et al., 1997], una trascrittasi inversa responsabile 
dell aggiunta dei nucleotidi all estremit  telomeri ca a partire dallo stampo fornito da TR 
(fig.1.1.3.b).  
Sembra inoltre da studi in vitro che la telomerasi sia un enzima processivo, in grado cioŁ di 
aggiungere piø ripetizioni telomeriche al DNA a cui Ł legato, prima di dissociarsi da esso [Kipling, 
1995]. Per fare ci  l enzima dovrebbe spostarsi lungo i l filamento neosintetizzato in modo da poter 
proseguire la sua attivit  di allungamento della se quenza telomerica. Il meccanismo ipotizzato, 
rappresentato in figura, presuppone l esistenza di uno stadio di traslocazione (fig. 1.1.3.c).