II
L’epidermolis i bollosa di s t r of i ca ( E B D) è una m al at t i a er edi tar i a
r ar a car atterizzata da l es i oni bollose e ulcer az i oni della cut e e del l e
mucose che s i risolvono con processi di cicatrizzazione di s t r of i ca.
L’EBD segrega i n maniera au t osomica, sia domi nante che r eces s i va.
Le for me domi nanti sono gener al mente più lievi, mentre le for me
r ecessive pr es entano quadr i clinici che vanno dal lieve al molto gr ave.
Le l es i oni bollose s ono local i z z ate al di sotto del l a l am i na dens a
del la membr ana basale e s ono dovute al l ’al ter az i one del l e f i br i l l e
ancor anti, microstrutture che mantengono l ’ades i one t r a i l derma e
l’epider mide ( F igur a 1 ) . Tutte l e for me di EBD sono dovute a
mutazioni nel gene COL 7 A1 che codi f i ca per il collagene di tipo VI I
(COLVII), principale cos t i tuente del l e f i br i l l e ancor ant i .
I l COLVII è un omotr imero, [α1(VI I )]3, cos tituito da m onomer i
di 300 KDa i n cui si distinguono tr e domini : un dominio non
collagenico ami no- terminale, un dominio centr ale col l agenico e un
breve domi ni o non collagenico car bos s i - terminale.
L’analis i di mutazioni in COL7A1 in pazienti affetti da E B D ha
mos tr ato una for te eter ogenei tà al l el i ca ( pi ù di duecento mutaz i oni
sono s tate i dent i f i cate) , dal momento che in generale ogni famiglia
presenta mutaz i oni private. Solitamente nel l e for me r eces s i ve di EBD
(EBDR) si osserva eter oz i gos i composta per 2 mutazioni diverse;
l’omozigos i per una s t essa mutaz i one è attesa nel caso di
consanguineità o di origine geogr af i ca comune dei genitori del
paziente. Le mutaz i oni sono pr es ent i lungo l ’i nter a s equenz a del
gene.
III
La r i cer ca di mutazioni in COL7A1 in pazienti affetti da E B D a
trasmis s ione dominante ha mos t r ato che ques te s ono gener al mente
causate da mutaz i oni “missense” che por tano al l a s os t i t uz i one di una
glicina nella s equenza r i petu ta Gl y -X-Y del dominio col l ageni co.
Nelle for me a t r as m i ssione r ecessiva l e mutaz i oni pi frequenti
sono di tipo “non sense” o “fr ame- shift”, causate da i n s er z i on i e
delez ioni di pochi nucleotidi. Queste mutaz i oni causano la for maz i one
di PTC (“Pr ematur e T er minat i on Codon of translation”) con
conseguente pr oduz i one di proteine t r onche e completamente non
funzionali, che non entrano a far parte delle f i br i lle ancor ant i . Nelle
forme E B DR pi lievi la mutaz i one PT C s i trova i n eterozigosi
compos ta con una mutaz i one “mi ssense” oppur e con mutazioni che
alterano l e giunz i oni di “splicing” e che tuttavia per mettono l a
maturazione di una cer ta quant i t à di mRNA funz ionale, che codi f i ca
per una pr otei na i n grado di entrare a for mar e l e f i br i l l e ancor ant i .
S copo di questo l avor o s tato l a r i cer ca di mutazioni in
COL7A1 in pazienti italiani affetti da E B D, sia per la car atterizzazione
molecolar e dei pazienti e l a confer ma del l a di agnos i di EBD, sia per lo
s tudio del l ’effetto bi ol ogi co di queste mutaz i oni , al fine di meglio
chiar ire l a correlazione genot i po- fenotipo in questa patol ogi a.
A tal e s copo gl i RNA pur i f i cat i da col t u r e di fibroblasti dermici,
che es pr i mono il COLVII, ottenuti da bi ops i e cutanee di pazienti EBD
e dei loro fami l i ar i , sono s tat i retrotrascr itti e i l cDNA del COLVII
s tato amplificato medi ante PCR utilizzando 2 2 set di “primer” che ne
copr ono l ’i nter a s equenz a.
IV
I prodotti di PCR sono s tat i sottoposti ad analisi di
“heter oduplex” in gel MDE e gl i amplimeri per i quali si sono
evidenziate bande anomal e s ono s tat i sottoposti a s equenz i ament o.
La pr es enz a del l e mutaz i oni stata ver i f i cata a l i vel l o del DNA
genomico medi ante di ges t i one con enzimi di restrizione o
sequenziamento.
I l gene COL 7 A1 stato anal i z z ato per la pr es enz a di mutazioni
in 9 pazienti affetti da E B D. Otto paz i ent i erano affetti dalla for ma
r ecessiva del l a mal attia; in particolare, 6 pazienti mostravano i segni
del la for ma s ever a di Hallopeau-S iemens (HS-EBDR) e 2 mostravano
un quadro clinico l i eve, tipico del l a for ma l ocalizzata di EBDR (non
HS -EBDR loc.). I l nono paz iente er a affetto dal l a for ma dom i nante
del la mal attia ( E B DD) .
Nei 9 pazienti analizzati sono s tate evidenz i ate 1 0 mutazioni
diver se, di cui 7 mai descritte in precedenza.
I dati ottenuti dall’analisi di mutazioni in questi pazienti sono in
accor do con le evi denz e gi à r i por tate s ul l a cor r el az i one genot i po -
fenotipo nel l ’E B D. In particolare, nei pazienti con la for ma s ever a H S -
EBDR, abbiamo osservato l a pr eval enz a di mutazioni PTC ( 8 alleli su
12), che hanno un impatto gr ave s ul l a s i n t es i di molecole di COLVII e
sulla for maz i one del l e f i br i l l e ancor ant i .
I n un paziente con fenotipo s ever o abbiamo osservato
eter ozigos i composta per una m ut az i one PT C ( 3 4 4 i n s G) e per una
mutazione “missense” (R2 063W). Questa mutaz i on e ha un effetto
sever o s ul l ’or gani zzazione e s ul l a funz i onal i tà del l e f i br i l l e ancor ant i ,
V
come dimos t r ato dal l ’anal i s i della cute del paziente che mos t r a una
r iduzione e un’al ter az i one s t r utturale del l e f i br i l l e ancor ant i .
I n entrambi i pazienti affetti dalla for ma l i eve e l ocal i z z ata del l a
patologia s t ata i den t i f i cat a eter oz i gos i composta per 2 diverse
mutazioni di “splicing” (4965C→T e 7 3 4 4 G→A) e per le mutaz i oni
sever e R 2 0 6 3 W e 4 8 2 7 -34del8. I l fenotipo l i eve di questi pazienti che
assemblano a l i vel l o della gi unz i one der mo-epider mica m ol ecol e di
COLVI I e f i br i l l e ancor ant i , da attribuire al fatto che l e 2 mutazioni
di “splicing”, benché caus i no la matur az i one di trascritti deleti che
vanno i ncont r o a “f r am e -shift”, con formazione di PTC, permettono
anche l a matu r az i one di una cer t a pr opor z i one di mRNA di corrette
dimens ioni. Poich le due mutaz i oni di “splicing” non portano a
sos tituz ioni aminoacidiche, nei 2 pazienti che por tano ques te
mutazioni viene matur ata una cer ta quant i t à di mRNA del COLVII di
tagl ia nor mal e che codi f i ca per molecole “wi l d type” funz ional i e i n
grado di entrare a for m ar e le f i br ille ancor ant i . Pertanto i l fenotipo
lieve di questi pazienti dovuto al l a pr es enz a di una cer ta quant i t à di
trascr itto e di proteina funz i onal e.
Nell’ultimo paz i ente, affetto dal l a for ma dom i nant e l i eve di
EBD, stata ev i denz i at a una mutaz i one “mi ssense”, la G2 0 7 0 E , mai
descr itta i n precedenza, che cade nel dominio collagenico del COLVII.
La s os t i t uz i one del l ’am i noaci do gl i ci na con un acido gl utammico
inter fer isce con l’organizzazione del l e mol ecol e a t r i pl a el i ca di COLVII
e por ta al l a for maz i one di fibrille ancor anti con r idotta funz i onal i tà.
T ra l e mutaz i oni in COL7A1 identificate i n questo l avor o l a
497insA s tata osservata i n omozigosi in 2 pazienti non correlati.
VI
Poiché i genitori di questi pazienti non sono cons anguinei , l’omozigosi
per questa mutaz i one da attribuirsi alla pr oveni enz a geogr af i ca
comune dei genitori o al fatto che l a mutaz i one 4 97insA l a pi
fr equente nei pazienti EBDR italiani.
T ra l e mutaz i oni identificate in questo l avor o anche la
7344G→A e l a R 2 0 6 3 W sono s tate osservate in pi pazienti italiani.
T uttavia, mentre la mutaz i one 4 97insA s tata i den t i f i cata
esclus ivamente nei pazienti italiani, le al t r e mutaz i oni sono s tate
descr itte anche i n pazienti di diversa pr oven i enz a geogr af i ca.
I n conclus ione, questo s tudi o ha per mes s o di caratterizzare a
livel lo molecolar e 9 pazienti affetti da E B D e di aggiungere nuove
evidenze ai dati già r i por tat i sulla correlazione genot i po - fenotipo in
ques ta pat ol ogi a.
Ques ti risultati, inoltre, hanno per messo di meglio
caratterizzare le mutaz i oni pi frequenti nei pazienti italiani,
contr ibuendo ad appr ontar e una s t r ategi a di identificazione r api da
del le mutaz i oni nei pazienti non ancora anal i zzati.
1
I NT R ODU Z I ONE
2
Le E pider mol i s i Bollose ( EB ) costituiscono un gruppo di patologie
autosomiche er edi tar ie r ar e del la cute, caratterizzate dal la pr es enz a di
les ioni bollose che s i sviluppano in seguito a t r aumi , anche di minima ent i t à,
a car i co della cut e e del le mucos e (B r ukner - T uderman, 1993). Le
manifes tazioni cliniche s ono mol to var iabi l i e, in base ad esse, si distinguono
forme del la malattia s ever e, letali e l ievi . L’incidenza complessiva delle E B è
di circa 1 . 2 4 /100
.
000 nati. Tutte le E B sono patologie autos omiche in cui
negli ultimi anni è s tato possibile dimos t r ar e i l coinvolgimento di un numero
elevato di geni che codi f icano per le componenti strutturali della gi unz i one
dermo-epidermica con conseguente s col lamento del derma s ot t os tante.
A s econda del livello cutaneo, in cui si formano le bol le, si distinguono
tre t ipi principali di EB:
1. FORME SIMPLEX (EBS), caratterizzate dal la local i zzazione
intraepidermica delle les ioni bollose, che s i originano per citolisi dei
cheratinociti basali.
2. FORME GIUNZIONALI (EBJ), in cui le bol le s i formano tr a
epidermide e der ma, a l i vel l o del la l ami na l uci da del l a gi unz i one der mo-
epidermica;
3. FORME DISTROFICHE (EBD), in cui la for maz i one di bolle s i
osserva al di sotto del la lam ina dens a della membrana bas ale, nel derma
papillare.
Le diver s e for me di EB e i geni coinvolti nella l or o ez iopatogenes i sono
elencate nel la T abel l a 1 .
3
T abella 1 . Forme di EB (Tadini et al., 1992).
F OR ME DI EB E r edit ar iet à Cr omosoma Gene
S E MP L I CE
Generalizzata di Koebner AD 17,12 K5, K14
Palmoplantare di Weber-
Cockayne
AD 17,12 K5, K14
Erpetiforme di Dowling-
Meara
AD 17,12 K5, K14
di Ogma AD 8
Con pigmentazione a ch i az z e AD 17,12 K5, K14
Localizzata AD
con ipo-anodontia di Kallin AR
Con malattia
neuromuscolare
AR 8 PLEC1
di Mendes da Cos t a XR
GI U NZ I ONAL E
Grave di Herlitz AR 1 LAMA3, LAMB3, LAMC2
I nversa AR
localizzata AR
Progressiva o neur otr ofica AR
Cicatr iziale AR
Emidesmosomica
Atrofica gener alizzata
benigna
AR 1 COL17A1, LAMB3
DI S T R OF I CA
Localizzata di Cockayne-
T ouraine
AD 3 COL7A1
Generalizzata di Pasini AD 3 COL7A1
Grave di Hallopeau-S iemens AR 3 COL7A1
Generalizzata non mutilante AR 3 COL7A1
I nversa AR 3 COL7A1
Localizzata AR 3 COL7A1
K5, K14: cheratina 5 e 14; PLEC1: plectina; LAMA3, LAMB3, LAMC2: laminina.
4
Giunzione der mo-epider mica
La gi unz i one der mo-epidermica l a r egi one anatomica i n cui l’epitelio
prende contatto con il derma s ottostante. Questa r egi one coinvolge due t ipi
cellular i diversi (Figura 1 ) .
F igur a 1 . Rappresentazione s chemat ica del l a gi unz i one der mo-epidermica i n cui
sono indicat i i livelli in cui si formano le bolle nel l ’E B . Sono inol t r e elencate l e pr i ncipal i
proteine pr es ent i ai vari livelli della gi unz i one che s ono coinvol te nell’eziopatogenesi dell’EB.
LL: lamina l uci da; LD: lamina dens a.
5
I cheratinociti basali dell’epitelio ader i s cono alla membr ana bas ale,
cos tituita dal doppio s tr ato del la l ami na l ucida, così chiamata per ché
trans lucida al microscopio ott ico, dello s pessore di 25-50 nm, e del la l am i na
densa del l o s pessore di 20-50 nm. L’adesione dei cheratinociti basali alla
membrana bas al e mediata dal complesso degli emidesmosomi. Ogni
comples s o emides mos omico cos t i tui to da una pl acca bas al e elettrondensa
pos ta all’interno del cheratinocita, una pl acca dens a s ot tobas al e e dai
filamenti ancoranti, che attraversano la l am i na l uci da e s ’i ns er i s cono nel la
lamina dens a. La membr ana bas ale col legata al derma dal microapparato
delle f ibr i l le ancor ant i , che for mano un complesso intr eccio tr idimens ionale,
nel quale s i trovano inter s per s e molecole di collagene inter s t i z iale e al t r e
s trutture micr of ibr i l lar i .
Le fibr i l le ancor anti sono aggr egati fibrosi del diametro di 20-75 nm
cos tituiti prevalentemente da col l agene di tipo VII (COLVII); questi
aggregati hanno una por z i one centr ale car atter i z z ata da un bandeggio non
per iodico con str iature incr ociate ed es t r emi tà s f i l accat e. L’estremità
super iore di ogni fibrilla s ’i n s er i s ce nel la lam ina dens a, mentre l ’es t r emi tà
infer iore di più fibrille pr ende contatto s ulle placche ancor ant i , strutture
elettrondense amor fe, che s i trovano a l i vel l o del derma papi llare s uper ior e
e che s i pensa s i ano cos t i tui te pr evalentemente da col l agene di tipo I V
(COLI V).
Un gran numero di macromolecole ent r a a far parte del la membrana
basale ( B r ukner - T uderman, 1993). Alcune s ono ben caratterizzate a l i vel l o
biochimico, altre, invece, sono note s olo per la l or o attività ant i gen i ca e non
se ne conos ce la s t r uttura e funz ione. I cheratinociti basali esprimono in
6
maniera s peci f i ca molti tipi di cheratine, delle qual i quelle maggior mente
espresse s ono le cher at ine 5 e 14 codificate dai geni KRT 5 e K RT 14 . Le
proteine pr es ent i nei complessi emidesmosomici sono l’ant igene 1 del
pemfigo bol los o codificato dal gene B PGA1 e la pl ect i na codificata dal gene
PLEC1, presenti nella por z i one int r acel lular e del complesso, e i l collagene di
tipo XVII, noto un tempo come ant igene 2 del pemfigo bol los o, codificato
dal gene COL 17A1, e le integr ine α6/β4 presenti nella por z i one
transmembrana ( U i tto et al., 1996, Figura 2 ) . La l ami na l ucida cos t i t u i t a
pr incipalmente da l am i n i na 5 , una molecola ad al to pes o molecolar e con
molti domini funzionali e con capacità di legarsi a mol t e al t r e
macromolecole. Probabilmente la s ua funz i on quella di contribuire
all’ancoraggio dei cheratinociti basali ai componenti della membr ana bas al e
(Uitto et al., 1992a). Fra le componenti della l ami na dens a, il COLIV,
cos tituisce un’impalcatur a t r i dimens i onale di sostegno per la lam ina dens a.
Ques ta s t r uttura v i ene r afforzata da pr oteogl i can i , come l ’epar ans ol fato, da
fibronectina e dai domini globulari amino- terminali delle molecole del
COLVI I . Le fibr i lle ancor ant i sono cos t i tui te pr incipalmente da mol ecol e di
COLVI I che s i aggregano come r ipor tato in Figura 4 . Le fibr i lle ancoranti
prendono contatto s uper ior mente con la l am ina dens a e infer ior mente con le
placch e ancor ant i del derma papi l l ar e. I l derma papillare cont iene molecole
di collagene di molti tipi diversi: collageni di tipo I , I I I , V, VI e
probabilmente di tipo X I I I . Queste molecole col lageniche, insieme ad al t r e
molecole s tr utturali quali la v i br onect i na, l’elastina, la f i br i l l i na, i
proteoglicani, formano lo s t r oma del derma ( Oder matt et al.).
7
S i presume che tutte le pr oteine des cr i tte f inor a vengano s intet izzate
dai cheratinociti basali e dai fibroblasti, ma s i ignora quali siano
precisamente le vie bios intet iche e le inter az ioni cellula-cellula che r egolano
la pr oduz i one e l ’as s emblaggio di questi componenti macromolecolari.
Alterazioni in diversi componenti della gi unz i one der mo-epidermica
(Figura 1 ) che coinvolgono i filamenti di cheratina e gl i emidesmosomi (a
livello dei cheratinociti), le molecole pr es ent i nella lamina l uci da, nella
lamina dens a e nel derma s ot t os t ant e, risultano tutte in patologie er edi tar ie
quali le E B , che s ono accom u n at e dalla pr es enz a di lesioni cutanee. I
pazienti affetti da E B presentano quadr i clinici diversi in rapporto ai geni che
sono colpit i e al tipo di mutazioni che al ter ano i geni codificanti per i diversi
componenti della gi unz ione der mo-epidermica.
F igur a 2 . Giunzione der mo-epidermica ev i denz i at a medi ante micr os copia el ettronica
(10
.
000 ingrandimenti): cher: cheratinocita; d: derma; LD: lamina dens a; LL: lamina l uci da;
ED: emidesmosomi; FA: fibrille ancor ant i .
9
a car i co dei geni KRT5 e K R T 14 , che caus ano la for maz i one di proteine di
lunghezza nor mal e, ma con scarsa tendenz a al l ’aggr egaz i one, che s i
organizzano in tonofilamenti molto fr agi l i , con conseguente fr agi l i tà del l a
cute ( Chr i s t iano et al., 1996a).
E pider molis i bollose giunzionali (EBJ)
Nelle for me giunz ional i la s epar az i one f r a epi der mi de e der ma avviene
all’interno del la l ami na l ucida del l a membr ana bas al e e la maggior parte
delle mutaz ioni interessa i geni codificanti le t r e s ubuni tà del l a l am i n i na 5 ,
una pr otei na fondamentale per i filamenti ancoranti. La l am i n i na 5 , detta
anche cal inina
cos t i t u i t a da t r e s ubuni tà det te α3, β3 e γ2 codificate da t r e
geni distinti. Finora s ono s tate ident i f icate mutaz ioni a car i co dei tre geni
LAMA3,LAMB3,LAMC2, mappat i in pos izione 1q25-31 e codi f icanti per le
subunità α3, β3, γ2 e a car i co del gene COL 1 7A1 .
Es is tono molte for me di EBJ, alcune mit i , altre gr avi o mol to gr avi,
tutte ad ins or genz a pr ecoce, caratterizzate da l es i oni che r iepi tel i z z ano poco
e s i risolvono con esiti atrofici, spesso s enz a ci cat r i ci residue. Nelle f or me
mit i (localizzata, generalizzata ed inver s a) le les ioni bollose s ono di s t r ibui te
al volto, a mani e piedi , al tronco e nelle gr andi pliche cutanee ( col lo, ascelle
e per ineo); spesso vengono coinvol te anche le mucos e, sono pr es enti
dis trofia ungueal e ed ipoplas ia dentar i a con anomalie a car i co del cemento e
dello s malto. I l decorso cr onico e s enz a mi glioramenti.
La var ian t e gr ave di Herlitz, che r appr es enta i l 50% circa del l e E B
congenite, compare alla nas ci t a con grosse les ioni soprattutto agli arti ed al
tronco, e les ioni crostose e con scarsa tendenz a al l a r i epi t el i zzazione a
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