Microscopio THz a Scansione Differenziale

Introduzione
Nell’intervallo dello spettro elettromagnetico tra le micro-onde e l’infrarosso,
si colloca una regione caratterizzata da una frequenza intorno al terahertz
(1 THz = 10
12
Hz), ancora poco esplorata (v. Fig. 1). La mancanza di
sorgenti sufficientemente intense ed economiche e di rivelatori opportuni per
questa regione spettrale ha impedito in passato lo studio e lo sviluppo di
eventuali applicazioni tecnologiche.
Larecenteinvenzionediunasorgentediradiazionecontinuaastatosolido,
economica e affidabile quale il laser a cascata quantica (QCL) operante nel
THz [4], rendendo di facile accesso l’emissione di radiazione in questa banda
spettrale, ha ispirato lo studio di dispositivi per imaging e spettroscopia nel
THz, aprendo la strada a una prolifica serie di ricerche in quest’ambito. La
radiazione THz costituisce infatti un soggetto di particolare interesse scienti-
ficoetecnologicoperviadellesueimportantiapplicazioni, chespazianodalle
ispezioni di sicurezza, ai controlli di qualit` a e in particolare alla diagnostica
biomedica.
Ladiffrazionedellaradiazioneelettromagneticarestringetuttavialamas-
sima risoluzione di un sistema ottico alla scala della lunghezza d’onda del-
la radiazione impiegata per l’illuminazione. Tale limite ` e particolarmente
stringente per lunghezze d’onda elevate come nel caso in esame (30 nullm÷
1 mm).
Losviluppodelletecnichedimicroscopiaotticaascansioneincampopros-
Figura 1: La regione del THz si colloca nello spettro elettromagnetico tra
le micro-onde e l’infrarosso ed ` e caratterizzata da una lunghezza d’onda nel
vuoto tra 30 nullm e 1 mm. L’energia di un fotone termico a temperatura
ambiente, 25 meV, corrisponde a una frequenza di circa 6 THz.
iv Introduzione
simo (NSOM) [1, 2] ha permesso comunque di abbattere tale limite, aprendo
un nuovo scenario per l’indagine della materia. Negli ultimi anni i ricerca-
tori si sono avvalsi di tale approccio anche nel dominio del THz, adattando
ad esso le metodologie stabilite nel visibile, oppure con lo sviluppo di nuo-
ve tecniche specifiche per questa regione spettrale. I risultati sono buoni dal
puntodivistadellarisoluzioneottenibile, masoffronodiunoscarsorapporto
segnale/rumore e di una rimodulazione dello spettro trasmesso dalla sonda,
difficolt` a che hanno finora impedito la spettroscopia spazialmente risolta.
Nell’ambito del presente lavoro di tesi, mi sono inserito in un gruppo di
ricerca, operante presso il Laboratorio NEST (National Enterprise for na-
noScience and nanoTechnology) della Scuola Normale Superiore di Pisa, il
quale intende sviluppare un’innovativa tecnica di caratterizzazione spettro-
scopica spazialmente risolta nella regione del THz, adattando a questo scopo
la tecnica di NSOM Differenziale (DNSOM), il cui principio di funzionamen-
to ` e stato recentemente dimostrato nella regione del visibile [3]. Tale tecnica
impiega la scansione di un’apertura rettangolare in campo prossimo rispetto
all’oggetto d’interesse, illuminato da una sorgente laser; l’intensit` a della lu-
ce raccolta da tale apertura viene registrata in funzione della posizione. La
ricostruzione dell’immagine ` e infine ottenuta operando la derivata seconda
bidimensionale della matrice dell’intensit` a, rispetto alle coordinate spaziali.
Nella tecnica DNSOM, la risoluzione in linea di principio risulta deter-
minata principalmente dalla precisione con cui sono realizzati gli angoli del
rettangolo che funge da sonda e non dalle sue dimensioni. Tale approc-
cio rende quindi possibile l’utilizzo di un’unica apertura, anche modulando
la frequenza dell’illuminazione entro un’ampia banda nel THz, per ottenere
dettagliate mappe spettroscopiche con un buon rapporto segnale/rumore.
Il contributo portato da questo lavoro riguarda lo studio del funziona-
mento della configurazione DNSOM, anche attraverso simulazioni numeriche
da me appositamente realizzate, e, in particolare, la realizzazione del setup
sperimentale completo per DNSOM nel THz.
Per le simulazioni mi sono avvalso del metodo FDTD (Finite Difference
Time Domain) [5, 6] e di un codice da me realizzato in linguaggio ANSI
C. Nel Capitolo 3 esporr` o i risultati ottenuti simulando il funzionamento
dell’apparato in funzione del tipo di apertura, variando anche la lunghezza
d’onda dell’illuminazione e la sua polarizzazione, per diverse distanze tra
apertura e campione.
Nel Capitolo 4 descriver` o la configurazione sperimentale adoperata, che
comprende uno stage piezoelettrico per la scansione ed il controllo della di-
stanza tra apertura e campione, un sistema di ottiche riflettenti per orien-
tare e focalizzare la radiazione, un microscopio ottico dotato di sensore di
immagini CCD per il controllo visuale dell’allineamento, un rivelatore piroe-
lettrico per la radiazione d’interesse ed un sistema elettronico di controllo e
v
acquisizione delle misure. Il funzionamento dell’apparato ` e stato verificato
sperimentalmente adoperando prima una sorgente laser a CO
2
, che emette
radiazione intensa a 30 THz, e poi utilizzando una sorgente QCL a 3 THz,
operante a temperature criogeniche e realizzata presso il NEST.
Le simulazioni da me realizzate permettono di determinare le condizio-
ni favorevoli di operativit` a con un approccio di tipo DNSOM, riguardo alla
polarizzazione della radiazione incidente e alla fabbricazione delle sonde, in-
dividuando dei limiti alla massima risoluzione spaziale ottenibile. Inoltre,
le misure presentate costituiscono la prima prova del funzionamento di un
microscopio a scansione differenziale. Infine,` e la prima volta che nell’ambito
della microscopia in campo prossimo viene utilizzata come sorgente un laser
a cascata quantica ad emissione nel THz.
I risultati ottenuti evidenziano la capacit` a del setup realizzato di operare
nel THz con risoluzioni spaziali decisamente migliori della lunghezza d’onda
impiegata e la possibilit` a di adoperare la stessa tecnica di microscopia in
campo prossimo in un ampio spettro di frequenze.
Capitolo 1
Imaging mediante Radiazione
Terahertz
Lo sviluppo delle prime tecniche di generazione e rivelazione di radiazione
THz ha aperto la strada ad una nuova regione inesplorata dello spettro elet-
tromagnetico. Tra le prime possibili applicazioni che la comunit` a scientifica
ha provato a sviluppare vi ` e l’utilizzo della radiazione THz nella diagno-
stica per immagini e nella sensoristica, seguendo le strade gi` a percorse per
applicazioni simili della radiazione visibile e a micro-onde.
1.1 Peculiarit` a della Radiazione Terahertz
Diverse sono le propriet` a peculiari della radiazione THz che suscitano l’in-
teresse della comunit` a scientifica verso questa regione spettrale e vengono
correntemente sfruttate per realizzare sistemi di imaging e di spettroscopia.
• Gran parte delle materie plastiche, come i comuni materiali di packa-
ging, sono trasparenti al THz, mentre i metalli e la ceramica risultano
riflettenti: questo ne permette la facile individuazione al di sotto di
indumenti o dentro contenitori trasparenti al THz. Inoltre, tale pro-
priet` a` e impiegabile a controlli di qualit` a non invasivi su oggetti opachi
al THz rivestiti di materiale plastico (circuiti integrati, alimenti, ecc.)
ed ` e stata storicamente sfruttata per realizzare le prime immagini in
trasmissione nel THz nel 1995, ad opera di B. B. Hu e M. C. Nuss [7],
che coniarono in tale occasione il termine “raggi T” per riferirsi alla
nuova regione spettrale (v. Fig. 1.1).
• La lunghezza d’onda al di sotto del millimetro permette di realizza-
re immagini nel THz con risoluzione (limitata dalla diffrazione, v. §
1.3) paragonabile a quella dell’occhio umano. Tale peculiarit` a, unita
2 Imaging mediante Radiazione Terahertz
(a) Visibile (b) THz
Figura 1.1: (a)Immaginediuncircuitointegratoasemiconduttore, ottenu-
ta con luce visibile. (b) Medesimo oggetto, visto in trasmissione ai “raggi T”.
Si tratta di una delle prime immagini acquisite in questa regione spettrale: ` e
possibile indagare il circuito integrato attraverso il rivestimento nero in resina
epossidica, che ` e trasparente al THz. La metallizzazione all’interno del dispo-
sitivo ` e chiaramente visibile, cos` ı come il wafer di semiconduttore nel centro.
La risoluzione spaziale dell’immagine ` e approssimativamente 250 nullm. Figure
adattate da B. B. Hu e M. C. Nuss [7].
alla precedente, viene attualmente proposta per effettuare ispezioni di
sicurezza, ad esempio negli aeroporti (v. Fig. 1.2).
• Molti materiali interessanti esibiscono un’originale impronta spettrale
nella regione del THz, che pu` o essere sfruttata per la loro identifica-
zione e analisi spettroscopica. Tra le varie sostanze, ve ne sono alcune
pericolose: stupefacentisinteticiqualiMDMA(ecstasy)elemetanfeta-
mine [9], il bacillo dell’antrace [10], esplosivi quali il C-4, HMX, RDX,
TNT [11], ecc. la cui individuazione ` e cruciale ed ` e resa possibile da
un’analisi nel THz (v. Fig. 1.3). Inoltre, con la radiazione THz si pos-
sono distinguere con precisione molecole farmaceutiche chimicamente
molto simili: nel processo di controllo di qualit` a del farmaco, ci` o con-
sentirebbe di conoscere con precisione la quantit` a di principio attivo
realmente inserita in una singola pillola, senza dover attendere i pi` u
lunghi test chimici sui diversi lotti.
•
`
E soprattutto dall’ambito biomedico che provengono le pi` u interessan-
ti prospettive di applicazione della spettroscopia nel THz. Il fatto di
avere una lunghezza d’onda maggiore rispetto alle dimensioni tipiche
dei costituenti i tessuti biologici diminuisce lo scattering al loro inter-
no. Inoltre, la radiazione THz non ` e ionizzante: le intensit` a adoperate
non causano alcun effetto nocivo sull’organismo e sono diversi ordi-
ni di grandezza pi` u basse di quelle raccomandate nelle indicazioni di
sicurezza.
Sfruttandotalipotenzialit` a,unarecentepubblicazionediradiologia[13]
ha riportato un accurato studio su immagini THz di tessuto canceroso
estratto dal seno umano, confrontate con le tradizionali diagnosi isto-
logiche. Nella chirurgia conservativa del seno, il fine ` e di asportare il
1.1 Peculiarit` a della Radiazione Terahertz 3
(a)
(b)
(c)
Figura 1.2: (a) Immagini THz (laterali) che evidenziano la presenza di
armi camuffate sotto gli indumenti, non percepibili a occhio nudo (foto al
centro): illustrano la possibilit` a di applicare la radiazione THz per i controlli
di sicurezza. (b) Fotografie della suola di una scarpa e degli oggetti nascosti
al suo interno. L’immagine a destra, realizzata con radiazione THz, dimostra
l’abilit` a di rivelare e identificare oggetti nascosti opachi al THz, in questo
caso una lametta da barba, un oggetto in ceramica e una piccola quantit` a
di esplosivo al plastico. (c) Fotografia di una valigia (a sinistra) e la stessa
ispezionata in trasmissione con radiazione THz (a destra), che evidenzia la
presenza all’interno di una grossa lama. La Fig. (a) ` e stata adattata da
www.teraview.com, le Figg. (b) e (c) sono tratte da W. L. Chan et al. [8].
4 Imaging mediante Radiazione Terahertz
Figura1.3: Immaginevisibile(asinistra)eunaseriediimmagininelTHz(in
colonna a destra) che mostrano tre differenti sostanze polverizzate contenute
in una busta da corrispondenza. Per ciascun pixel, viene raccolto lo spettro
sintonizzando la sorgente tra 1 e 2 THz: il riconoscimento della sostanza viene
effettuato sulla base del suo noto assorbimento spettrale. Figura adattata da
K. Kawase et al. [9].
tumoreconunadeguatomargineditessutosano, minimizzandoalcon-
tempolaquantit` aditessutorimosso. Neicasiincuiimargininonsono
bendefinitidopol’asportazione,laricorrenzadeltumorealungotermi-
ne ` e pari al 10%-20% dei casi, contro il 2%-8% dei casi in cui i margini
sono netti. Allo stato attuale, la diagnosi viene appurata solo giorni
dopo l’intervento, in seguito all’analisi istologica del tessuto rescisso,
che pu` o anche richiedere una seconda operazione per asportare altro
tessuto vicino. Vi` e quindi un’esigenza clinica di definire accuratamen-
teimarginideltumoreinsedechirurgica,alfinediconservareiltessuto
sano e di minimizzare il numero di ulteriori procedure chirurgiche.
Ilrisultatodellostudiocitato` eincoraggiante: latecnicadiimaging nel
THzadoperata,lavorandosultessutoinriflessione,riesceadindividua-
re diverse tipologie di carcinoma al seno, con risoluzione comparabile
a quella dell’analisi istologica, ottenuta mediante fotomicrografia (v.
Fig. 1.4). Ci` o prelude ad una eventuale diagnosi del tessuto canceroso
in situ, che ridurrebbe drasticamente i rischi legati ad un’asportazione
non adeguata.
• Un’altra peculiarit` a del THz ` e il fatto che l’acqua, di cui, com’` e noto,
` e costituita gran parte dei tessuti biologici, offre un forte assorbimento
centrato attorno a 5,4 THz [12]. Non ` e difficile, a questo punto, pen-
sare alle svariate applicazioni che tale propriet` a pu` o avere nell’ambito
dell’imaging e della spettroscopia. Infatti, se da una parte essa restrin-
1.2 Spettroscopia nel THz per Diagnosi Genica 5
(a) Fotomicr. (b) THz (c) Fotomicr. (d) THz
Figura 1.4: (a) Immagine realizzata tramite fotomicrografia e (b) tramite
radiazione THz di un carcinoma duttale invasivo. Definizione dell’area inte-
ressata dal carcinoma tramite amplificazione numerica del contrasto per (c)
l’immagine fotomicrografica e (d) l’immagine nel THz. Immagini tratte da J.
A. Fitzgerald et al. [13].
gelaprofondit` adipenetrazioneall’internodeitessutiviventi,dall’altra
offre importanti opportunit` a all’analisi istologica. La pi` u importante
applicazione in tal proposito riguarda lo studio del tumore sub-cutaneo
della pelle, a causa del fatto che le cellule cancerose presentano un ac-
cumulo di acqua, propriet` a che viene dunque utilizzata come mezzo di
contrasto nella diagnostica.
Un esempio di una simile applicazione ` e illustrato in Fig. 1.5: un
volontario ` e stato sottoposto a una lieve scottatura da freddo su di
un’area della pelle e poi monitorato tramite imaging in riflessione nel
THzfinoa30minutidopolascottatura. Sebbenenessuncambiamento
siavisibilenelleduefotografiedell’areainteressata,leimmagininelTHz
identificano un edema risultante dalla scottatura. I raggi T sono stati
dunqueingradodipenetrarelostratocorneo(ilpi` uesternodellapelle)
e di fornire informazioni sugli strati sottostanti.
• Infine, particolare attenzione merita l’applicazione della spettroscopia
a raggi T alla diagnosi genica, argomento che verr` a sviluppato nel
dettaglio nel prossimo paragrafo.
1.2 Spettroscopia nel THz per Diagnosi Ge-
nica
Una delle principali sfide della biotecnologia consiste nello sviluppo di si-
stemi e dispositivi semplici e flessibili capaci di analizzare rapidamente il
materiale genetico. A tal fine, sono stati sviluppati negli ultimi anni dei
sensori biologici (biochip) che identificano le sequenze polinucleotidiche del
DNA attraverso la rilevazione del legame (ibridizzazione) tra le molecole
6 Imaging mediante Radiazione Terahertz
(a) 10 min (b) 30 min
(c) THz
Figura 1.5: (a), (b) Fotografie dell’area di braccio di un volontario sotto-
posta a una lieve scottatura da freddo, dopo 10 e 30 minuti. Non si evidenzia
alcun cambiamento sulla superficie della pelle. (c) Serie di immagini in rifles-
sione nel THz, subito prima e ad intervalli dopo la scottatura.
`
E evidente la
formazione di un edema sub-cutaneo dopo alcuni minuti. Immagini adattate
da www.teraview.com.
di DNA sconosciute e delle sequenze oligo- o polinucleotidiche di DNA a
singolo filamento (denaturato), sfruttate come sonda di composizione nota.
L’ibridizzazione avviene infatti preferibilmente tra molecole con sequenze di
basi azotate complementari.
Attualmente la rilevazione dell’ibridizzazione si basa largamente sulla
marcatura con cromofori fluorescenti del filamento di DNA incognito. Seb-
bene questa tecnica abbia dato origine a sistemi diagnostici molto efficienti,
appare doveroso indagare schemi di rilevazione alternativi, dal momento che
la marcatura non solo costituisce una fase preparatoria addizionale, ma pu` o
modificarelaconformazionedelfilamentodiDNAincognitoriducendolapre-
cisione della rilevazione dei geni. A questo si aggiunga che la degradazione
dei fluorofori, le fluttuazioni della resa dei marcatori e la dipendenza dell’ef-
ficienza della fluorescenza dal particolare sito deteriorano la quantificabilit` a
dell’indagine in studi comparativi.
Calcoli teorici hanno predetto una moltitudine di risonanze nella regione
spettrale del THz per le molecole di DNA, associate a eccitazioni di tipo
fononico o plasmonico. Sfruttando tale propriet` a, M. Brucherseifer et al. [14]
hanno dimostrato la possibilit` a di applicare la spettroscopia nel THz per
l’identificazionedellostatolegatodellemolecolediDNA,evitandodiricorrere
1.2 Spettroscopia nel THz per Diagnosi Genica 7
(a) (b)
(c) (d)
Figura 1.6: (a) Spettro THz adoperato. (b) Confronto della variazione di
trasmissione in funzione della frequenza dovuta ai campioni di DNA per un
campione denaturato e due differenti campioni ibridizzati. Tale variazione ` e
stata calcolata rispetto al riferimento senza il campione e poi normalizzata
rispetto a ciascun riferimento. (c) Parte reale e (d) immaginaria dell’indice
dirifrazione ˜ n(ν) = n(ν)−ik(ν)deicampionidiDNA,calcolatodaglispettri
di trasmissione nel THz. Si evince uno scostamento tra il DNA ibridizzato
e quello denaturato pari a Δn ≈ 0,1 e Δk ≈ 0,05. Figure tratte da P.
Haring-Bolivar et al. [15].