Meccanismi molecolari coinvolti nel differenziamento neuronale indotto da Acido retinoico nella linea cellulare di neuroblastoma umano SH-SY5Y

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L’attivazione di MEK, ERK1 e ERK2 è stata osservata anche in seguito a 
trattamento con Wortmannina, inibitore selettivo del PI3K, enzima in grado di 
attivare la PKC. 
Infine sono stati valutati la localizzazione intracellulare di ERK1 e ERK2 una 
volta attivate con acido retinoico e il ruolo dell’attivazione di queste molecole 
nel differenziamento neuronale delle cellule di neuroblastoma umano SHSY5Y: 
utilizzando l’allungamento del neurite come indicatore per l’avvenuto 
differenziamento, si è determinata la percentuale di cellule differenziate dopo 
24h di trattamento con acido retinoico in presenza di specifici inibitori della 
fosforilazione delle chinasi studiate. 
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INTRODUZIONE 
 
 
 
1. LE PROTEINE STUDIATE: 
ERK1 E ERK2 
 
 
Le MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) sono una famiglia di serin-treonin 
chinasi espresse in tutte le cellule eucariotiche, nelle quali svolgono un ruolo 
fondamentale in numerosi processi cellulari tra cui la proliferazione, il 
differenziamento, l’apoptosi e la trasformazione [1]. 
Le MAPK sono attivate per fosforilazione in seguito a diversi stimoli 
extracellulari (citochine, fattori di crescita, neurotrasmettitori o ormoni) o 
all’adattamento a condizioni di stress ambientale (irradiazione da raggi 
ultravioletti, shock termico, antiossidanti, inibitori di sintesi proteica o cambio 
della osmolarità di membrana) [2]. 
Le MAPK vengono rapidamente attivate attraverso una cascata enzimatica 
costituita da un modulo di tre chinasi sequenziali:  
 
1. MKKK (MAP Kinase Kinase Kinase) 
Le MKKK sono serin-treonin chinasi che, per essere attivate necessitano sia 
della fosforilazione da parte di un enzima MKKKK sia dell’interazione con 
una proteina legante il GTP, appartenente alla famiglia Ras o Rho 
[Widmann, ‘99]. Una volta  attivata, MKKK fosforila la chinasi successiva nel 
modulo, MKK. 
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2. MKK (MAP Kinase Kinase)  
Gli enzimi appartenenti alla famiglia MKK sono treonin-tirosin chinasi molto 
specifiche, infatti in seguito ad attivazione sono in grado di fosforilare in 
maniera esclusiva e specifica le MAPK.  
3. MAPK 
Gli enzimi che appartengono alla famiglia MAPK, una volta attivati 
fosforilano diversi substrati sia citoplasmatici che nucleari.  
 
La conservazione dei componenti che determinano l’attivazione di MAPK in 
diverse specie di eucarioti inferiori così come nei mammiferi, dimostra 
l’importanza di queste molecole nello sviluppo dell’organismo.  
Il lievito rappresenta il modello sperimentale dove probabilmente il pathway di 
attivazione delle MAPK è stato studiato in maniera più approfondita. 
In Saccharomyces cerevisiae sono state identificate 5 MAPK coinvolte nella 
formazione del “mating type”, nel rimodellamento della parete cellulare e nella 
risposta a diversi stress cellulari come i cambiamenti di osmolarità: STE5, STE7, 
STE11, FUS3 e KSS1 [3]. Il lievito può esistere sia come cellule aploidi che 
diploidi. Le cellule diploidi hanno due possibili fenotipi sessuali, caratterizzati 
dall’espressione di un gruppo di geni coinvolti nelle formazione del mating type; 
questi geni non sono invece inattivi nelle cellule aploidi. 
In seguito al legame dei ferormoni ai rispettivi recettori, si determina, 
attraverso la stimolazione delle MAPK, la maturazione del mating sessuale e 
cambiamenti metabolici e morfologici [4].    
L’allineamento della sequenza di un gruppo di MAPK di mammifero, ERK1 e 
ERK2, con le sequenze di proteine chinasi come FUS3 e KSS1 presenti in 
Saccharomyces cerevisiae, ha mostrato una forte correlazione, dimostrando 
l’alta omologia esistente tra le MAPK di mammifero e quelle di lievito [5]. 
Al momento in cellule di mammifero sono stati identificati 14 membri della 
famiglia MKKK, 7 membri della famiglia MKK e 12 membri appartenenti alla 
famiglia MAPK. Le MAPK sono ulteriormente suddivise in 5 gruppi, ciascuno con 
distinte funzioni biologiche:  
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 ξ  ERK (Extracellular Signal Regulated Protein Kinase) che, con le sue isoforme 
ERK1 e ERK2, è tra i gruppi di MAPK quello maggiormente coinvolto nel 
differenziamento e nella proliferazione cellulare. ERK1 e ERK2 sono proteine 
ubiquitariamente espresse, stimolate da fattori di crescita o agenti 
differenziativi e determinano l’attivazione di fattori di trascrizione e altre 
proteine chinasi.  
 ξ  p38 e JNK/SAPK (Jun NH2-teminal Kinase/Stress-Activated Protein Kinase), 
sono proteine presenti in diversi tipi cellulari e implicate nelle risposte a 
condizioni di stress ambientale, infiammazione e apoptosi. I membri di 
entrambe le famiglie sono attivate dai lipopolisaccaridi, citochine 
proinfiammatorie, TNF- ∆ (Tumor Necrosis Factor), raggi ultravioletti e 
farmaci chemioterapici antitumorali [6]. 
Sia p38 che JNK/SAPK comprendono diversi sottogruppi, rispettivamente: 
 ∆/ Ε/ ϑ/ Γ e  1/2/3 [6]. 
 ξ  Gli altri 3 gruppi comprendono: ERK3, localizzata nel nucleo e attivata da 
diverse isoforme della PKC [7]; ERK4, proteina attivata in risposta all’NGF 
(Nerve Growth Factor) e all’EGF attraverso una modalità dipendente 
dall’enzima Raf [8]; infine ERK5, che rimane la meno caratterizzata.  
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1.1 Attivazione delle MAPK: duplice fosforilazione 
nel loop di attivazione 
 
L’attivazione delle MAPK avviene in seguito alla duplice fosforilazione da parte 
di MKK nella sequenza aminoacidica conosciuta come “loop di attivazione”: 
treonina – X – tirosina, dove X risulta essere un aminoacido diverso per ciascun 
gruppo di MAPK: acido glutammico per ERK1 e ERK2, prolina per JNK/SAPK, 
glicina per p38 [9].  
Il processo avviene in una reazione parzialmente ordinata dove la fosforilazione 
in tirosina precede sempre quella in treonina ed entrambi gli eventi di 
fosforilazione sono richiesti per la completa attivazione della MAPK [10].  
Nel modulo di attivazione ciascun gruppo di MAPK viene attivato da un enzima 
specifico appartenente alla famiglia di enzimi MKK: gli enzimi MEK1 e MEK2 
fosforilano selettivamente ERK1 e ERK2 [FIG. 1], MEK4 e MEK7 attivano 
JNK/SAPK, MEK3 e MEK6 sono specifici per p38 e, infine,  
MEK5 riconosce e fosforila ERK5 [11]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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FIG. 1: ERK1 e ERK2 vengono attivate per fosforilazione secondo una modalità 
che comprende l’attivazione in un modulo a tre chinasi sequenziali. In questo 
modulo, di cui ERK1 e ERK2 rappresentano gli ultimi substrati, sono presenti 
anche MEK e Raf. ERK1 e ERK2, una volta fosforilate in sguito a stimolazione 
con fattori di crescita o neurotrofine (fattori che prevedono l’interazione con 
recettori in membrana), traslocano dal citoplasma al nucleo, dove, attrverso 
lafosforilazione di determinati fattori di trascrizione, intervengono nella 
regolazione dell’espressione genica. 
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1.2 ERK1 e ERK2  
 
All’inizio degli anni ’80, in differenti tipi cellulari è stato osservata la presenza di 
una proteina di 42-kDa che veniva fosforilata a livello di residui di tirosina in 
seguito a stimolazione con fattori di crescita come il PDGF (Platelet-Derivated 
Growth Factor) e l’EGF (Epidermal Growth Factor) [12]. Altri studi rilevarono 
che proteine della stessa dimensione erano fosforilate (sempre in tirosina) in 
cellule trattate con esteri del forbolo, in cellule trasformate da virus e in oociti 
di Xenopus laevis arrestati in metafase [1]. Nello stesso periodo, la 
caratterizzazione di proteine chinasi attivate dal recettore per l’insulina, ha 
favorito l’ipotesi che questo recettore potesse avere un ruolo nell’attivazione di 
questa proteina di 42-kDa fosforilata in tirosina [13]. 
Successivamente in cellule di fibroblasti 3T3-L1 stimolate con insulina è stata 
isolata una serin-treonin chinasi di 42-kDa, chiamata “MAPK” (Mitogen-
Activated Protein Kinase) [14]; tale proteina era fosforilata in residui di treonina 
e tirosina. La MAPK di 42-kDa fosforilata in risposta all’insulina era la stessa 
proteina descritta in precedenza che veniva attivata in risposta all’EGF e al 
PDGF, agli esteri del forbolo, alla trasformazione indotta da virus e dagli oociti 
arrestati in metafase. 
Il cDNA codificante la 42-kDa MAPK è stato isolato nel 1990, poco tempo prima 
(nel 1988) veniva sequenziato il cDNA di un’altra MAPK di 44-kDa; le proteine 
di 44- e 42-kDa sono state successivamente rinominate rispettivamente ERK1 e 
ERK2 (Extracellular signal-Regulated Kinase1 e 2) per la variabilità degli stimoli 
extracellulari che ne determinano l’attivazione [15]. 
 
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ERK1 e ERK2 sono proteine con il 90% di identità della sequenza aminoacidica 
[6] e presenti a livelli micromolecolari in tutte le cellule di mammifero [11], 
anche se sono state osservate delle variazioni nell’espressione tra differenti 
tessuti [16]. 
Entrambi gli enzimi sono attivati per fosforilazione a livello di un residuo di 
treonina e tirosina della sequenza amminoacidica detta loop di attivazione: 
Treonina183 - acido glutammico - Tirosina185. Un modello per l’attivazione di 
ERK1 e ERK2 prevede l’iniziale fosforilazione del residuo di tirosina in posizione 
185, seguita da una sostanziale riconfigurazione del loop (il residuo Tyr185 non 
fosforilato, nasconde quello Thr183) affinché possa essere fosforilato anche il 
residuo Thr183 da parte di MEK [17]. 
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1.3 Il modulo di attivazione di ERK1 e ERK2 
coinvolge tre chinasi 
 
L’interazione dei recettori per fattori di crescita con i rispettivi ligandi determina 
l’inizio della cascata enzimatica che culminerà con la fosforilazione di ERK1 e 
ERK2. 
 
Dopo l’interazione con il ligando, il recettore dimerizza e si autofosforila a livello 
dei residui di tirosina presenti nella regione C-terminale; il processo di 
dimerizzazione è importante per l’attivazione del dominio chinasico [18]. 
L’attività tirosin-chinasica del recettore è essenziale per mediare l’azione del 
fattore di crescita e altrettanto importante per la trasduzione del segnale è 
l’autofosforilazione del recettore: i residui di tirosina fosforilati diventano infatti 
dei siti di legame specifici per proteine che contengono domini SH-2 (Src 
Homology-2). Una delle proteine che contengono domini SH-2 è l’adattatore 
GRB2, legato al fattore di scambio per nucleotidi guaninici della p21Ras, Sos1, 
mediante i domini SH-3 (Src Homology-3). In seguito a stimolazione con il 
fattore di crescita, il complesso GRB2-Sos1 si lega alle fosfotirosine del dominio 
C-terminale del recettore stesso. Grazie a questa interazione, Sos1 viene 
portato dal citoplasma alla membrana cellulare dove può attivare p21Ras, 
catalizzandone il passaggio dalla forma inattiva p21Ras-GDP, alla forma attiva 
p21Ras-GTP. p21Ras-GTP attiva una chinasi appartenente alla famiglia MKKK, 
in grado di attivare un enzima della famiglia MKK; a sua volta l’enzima MKK 
avrà come target di fosforilazione una MAPK.  
Nel caso dell’attivazione di ERK1 e ERK2 da parte dei fattori di crescita, il 
modulo a 3 componenti è costituito da Raf (MKKK), che una volta attivato, 
determinerà la fosforilazione di MEK (MKK), una treonin-tirosin chinasi capace 
di riconoscere e fosforilare in maniera unica e specifica il dominio di attivazione 
nel loop di ERK1 e ERK2 (MAPK).   
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Raf 
I membri della famiglia di proteine Raf sono serin-treonin chinasi coinvolti nella 
trasduzione del segnale dalla membrana citoplasmatica al nucleo e 
comprendono: A-Raf, B-Raf e Raf-1. A-Raf, ubiquitariamente espressa [19], è 
attivata in risposta al trattamento con esteri del forbolo, siero o endotelina-1, 
mentre B-Raf, proteina di 96kDa espressa soprattutto in cellule neuronali e 
neuroendocrine, sembra essere l’attivatore specifico di MEK nel cervello [20]. 
Raf-1 è espressa ubiquitariamente ed è l’isoforma proteica maggiormente 
studiata nel modulo di attivazione da parte dei fattori di crescita. L’attivazione 
necessita sia dell’associazione con il complesso Ras-GTP (fondamentale per 
legare Raf-1 a livello della membrana), sia di una fosforilazione che può 
avvenire a livello di diversi residui di serina (Ser43, Ser259, Ser499 o Ser621), 
treonina340 o tirosina268 [21]. 
La fosforilazione di Raf-1 a livello dei residui di serina, può avvenire da parte:  
 ξ  della PKC (Protein Kinase C) [22] 
 ξ  del gruppo di proteine 14-3-3, proteine dimeriche coinvolte nel ciclo 
cellulare [23].  
L’attivazione di Raf-1 può avvenire per fosforilazione a livello del residuo di 
tirosina-340 e tirosina-341 da parte di proteine tirosin chinasi, come Src, Fyn o 
JAK. Questo sistema coinvolge i recettori per citochine, eritropoietina, 
interferone e ormone della crescita [21]. Anche il trattamento con esteri del 
forbolo portano all’attivazione di Raf-1, determinandone la fosforilzione in 
treonina-268 [24]. 
In seguito all’attivazione Raf-1 è in grado di esercitare la sua attività serin-
treonin chinasica e di conseguenza l’attivazione di MEK (MAP ERK Kinase). 
Infine, Raf-1 può essere fosforilato dalla PKA (Protein Kinase dipendente 
dall’cAMP) a livello della serina 621, ma in una modalità che inibisce l’attività di 
questo enzima: in seguito a tale fosforilazione, si osserva una riduzione 
dell’affinità di Raf-1 per la forma di Ras legata al GTP. Questo meccanismo 
costituisce un di feedback inibitorio per l’attivazione di ERK1 e ERK2 [25].  
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MEK 
Il gruppo di enzimi MEK (MAP ERK Kinase) comprende le due isoforme MEK1 e 
MEK2 entrambe di 44-kDa e con identità di sequenza aminoacidica correlata 
all’80% [26]. 
L’attivazione di MEK avviene per fosforilazione a livello della sequenza del loop 
di attivazione Ser218-Met-Ala-Asn-Ser222 e a differenza di ERK1 e ERK2, MEK 
può essere attivato anche solo parzialmente, dopo fosforilazione di uno solo dei 
due residui di serina [27]. 
Alcune sequenze in MEK ricche in Prolina contengono sequenze consenso per 
interazioni potenziali con domini SH3. In MEK sembra che questo dominio sia 
importante per le interazioni  con Raf-1; infatti delezioni di questi residui 
interferiscono con l’attivazione dei substrati ERK1 e ERK2 e con i segnali di 
crescita nelle cellule [28].  
Il ruolo fondamentale di MEK nella fosforilazione ed attivazione di ERK1 e ERK2 
è stato confermato mediante l’impiego dell’inibitore PD98059, specifico nel 
bloccare l’attivazione dell’enzima MEK, in diverse linee cellulari [8 e 29]: 
 ξ  nelle cellule PC-12, il trattamento con l’inibitore non ha effetto sulla 
fosforilazione del recettore per l’NGF, ma riduce di 4 volte l’attivazione di 
ERK1 e ERK2 indotta con questo fattore neurotrofico e inibisce il 
differenziamento in senso neuronale delle cellule PC12 [10] 
 ξ  nelle cellule 3T3 il PD98059 riduce dell’80-90% l’attivazione di MEK e riduce 
la proliferazione cellulare [30]. 
L’enzima MEK possiede un segnale di esporto nucleare che ne determina la 
localizzazione citoplasmatica, dove in uno stato inattivo è in grado di 
sequestrare ERK1 e ERK2 nel citoplasma [31]. Per poter essere attivate, ERK1 
e ERK2 necessitano della fosforilazione di MEK e della dissociazione da 
quest’ultimo; successivamente saranno inattivate per defosforilzione da parte di 
specifiche fosfatasi e ritorneranno nella forma inattiva riassociata a MEK [6]. 
 
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In vitro, MEK viene fosforilato e quindi attivato da almeno due famiglie di 
protein chinasi [FIG. 2]: 
 ξ  Raf-1 (in seguito a trattamento con fattori di crescita e conseguente 
attivazione di recettori tirosin chinasi e recettori accoppiati a proteine-G) e 
B-Raf (fosforila MEK in alcune linee cellulari in risposta a NGF, EGF e PDGF) 
[32] 
 ξ  c-mos, una proteina chinasi specifica per cellule germinali che controlla la 
divisione cellulare meiotica [33].  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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FG. 2: Il modulo di attivazione a tre chinasi in ognuna delle famiglie di MAPK 
include: una MAP Kinase Kinase Kinase (MKKK), che sono Raf-1, A-Raf o B-Raf, 
una MAPK/ERK Kinase (MEK) e un enzima appartenente alla famiglia MAPK 
(nello studio oggetto di questa tesi ERK1 e ERK2)