Meccanismi della tossicità acuta della diossina in cellule INS-1

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una modesta protezione nei confronti della citotossicità da TCDD. D’altra 
parte, l’incubazione per 1 ora con TCDD non provoca significative variazioni 
dei livelli intracellulari di glutatione ridotto. Una significativa e molto più 
evidente protezione può essere invece ottenuta utilizzando il flavonoide di 
origine vegetale epigallocatechina gallato (200 µM), che sembra agire come 
inibitore del recettore arilico, al quale si lega la TCDD una volta entrata nella 
cellula.  
Nel tentativo di individuare un possibile meccanismo della citotossicità della 
TCDD, abbiamo dimostrato che l’esposizione delle cellule INS-1 alla TCDD 
provoca rapidamente (nel giro di pochi secondi) un drammatico aumento 
della concentrazione intracellulare di Ca
2+
 fino a raggiungere livelli in grado di 
danneggiare gravemente le cellule, probabilmente agendo a livello 
mitocondriale.  
Infine, abbiamo studiato gli effetti di 1 ora di incubazione con dosi non 
citotossiche di TCDD (0.05, 0.5 e 1.0 nM) sulla funzione secretoria delle 
cellule INS-1. I nostri risultati indicano che la TCDD è in grado di far diminuire 
significativamente, in maniera dose-dipendente, la secrezione di insulina 
stimolata da dosi crescenti di glucosio (2.8, 5.6, 8.3 e 11.2 mM) rispetto a 
quella delle cellule di controllo. Come ulteriore conferma del ruolo importante 
dei mitocondri nel meccanismo della tossicità da TCDD, abbiamo dimostrato 
che la secrezione di insulina stimolata da una concentrazione depolarizzante 
di KCl (30 mM) non è influenzata dall’esposizione alle stesse dosi di TCDD in 
grado invece di inibire la secrezione stimolata dal glucosio. 
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In conclusione, i nostri risultati dimostrano che la TCDD è in grado di indurre 
un grave danno acuto delle cellule INS-1 a concentrazioni comprese fra 10 e 
50 nM, e che concentrazioni ancora minori, non citotossiche, di TCDD 
possono provocare significative alterazioni della funzione secretoria di queste 
cellule. Queste osservazioni potrebbero assumere particolare importanza in 
relazione alla sempre maggiore incidenza del diabete di tipo 2 registrata negli 
ultimi decenni. Tale osservazione ha infatti indotto diversi autori ad ipotizzare 
l’intervento di fattori ambientali ancora sconosciuti che andrebbero ad 
aggiungersi ai classici fattori legati alla dieta e alla mancanza di esercizio 
fisico nella patogenesi di questa malattia.  
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ABSTRACT 
 
Several epidemiologic studies have indicated a possible correlation between 
dioxin exposure and diabetes. However, only few biological studies have 
addressed the question of the interactions between dioxin-like compounds 
and secretory function of pancreatic β cells. The aim of the present research 
was to characterize TCDD-induced toxicity on the insulin-secreting cell line 
INS-1E, which is considered to be a reliable β-cell model. First, we 
investigated the effects of 1 h exposure to different concentrations of TCDD 
(0, 1, 3, 6, 12.5, 25 and 50 nM) on cell survival and we observed a sharp 
decline of cell survival (below 20% with respect to control untreated cells) for 
TCDD concentration between 12.5 and 25 nM. Ultrastructurally, cell death 
was characterized by extensive degranulation, appearance of autophagic 
vacuoles containing cytoplasmic structures and especially mitochondria, 
peripheral nuclear condensation and disappearance of cytoplasmic 
organelles. TCDD toxicity was only slightly prevented by pre-exposure of the 
cells to the anti-oxidant dehydroascorbic acid. On the other hand, no 
changes in the intracellular GSH levels were observed after 1 h TCDD 
exposition. A significant and more relavant protection against TCDD toxicity 
was afforded by the AhR inhibitor epigallocatechin gallate (200 µM). At this 
regard, preliminary observations seems to indicate that acute dioxin toxicity 
might be AhR-mediated throught a non-trascriptional mechanism, probably 
related to a TCDD-induced increased cellular Ca
2+
 uptake. The main finding 
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of our research was the observation that 1 h exposition of INS-1E cells to 
non-citotoxic TCDD concentrations (0.05, 0.05 and 1 nM) caused a 
significant, dose-related impairment of glucose-stimulated insulin secretion. 
One hour incubation with 1 nM TCDD almost completely abolished insulin 
secretion above basal levels in response to several stimulating glucose 
concentrations (from 5.6 to 11.2 mM). In conclusion, our results clearly show 
that TCDD can acutely damage INS-1E cells at concentrations in the 
nanomolar range, and that lower, non-cytotoxic doses of TCDD can rapidly 
induce significant alterations of their glucose-stimulated secretory response. 
This latter observation could be important in view of the increasing 
prevalence of type 2 diabetes in the last decades and the possible 
pathogenetic contribution of still unknown environmental factors in addition to 
obvious nutritional habits. 
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INTRODUZIONE 
 
1. Storia della diossina 
Il termine Diossina è comunemente usato per riferirsi ad una famiglia di 
sostanze chimiche tossiche strutturalmente correlate,  con un comune 
meccanismo d’azione ed un comune spettro di risposte (Van der Berg M. et 
al., 1998). Questo gruppo include le dibenzo-p-diossine policlorurate 
(PCDDs), i dibenzo-furani policlorurati (PCDFs) e i bifenili policlorurati 
(PCBs). Fra tutti questi composti è noto da tempo che la sostanza più 
tossica è certamente la 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-diossina nota più 
semplicemente come diossina o TCDD (Poland A. and Knutson J.C., 1982; 
Whitlock JPJ,1990; Matsumura F, 1995). 
Le Diossine sono contaminanti ambientali che si formano come prodotti 
secondari in processi industriali quali l’incenerimento dei rifiuti (Olie K.,1980; 
Enviromental Protection Agensy (EPA), 2004), lo sbiancamento della carta 
e la produzione di pesticidi, erbicidi e fungicidi (Gilpin R.K. et al., 2003). Per 
meglio valutare il rischio associato a questi composti, ad ognuno di essi è 
stato associato un fattore di equivalenza tossica (TEF) che viene espresso 
in relazione al potenziale tossico della TCDD assumendo un TEF per la 
TCDD=1(Van der Berg M. et al., 1998). Il metodo del TEF è stato utilizzato 
per calcolare la quantità di diossine nel corpo umano. La media stimata in 
una generica popolazione è di circa 58 ng di equivalenti di TCDD (TEQ)/Kg 
di lipidi sierici, che corrispondono a 13 ng TEQ/Kg di peso corporeo. Nelle 
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popolazioni con una più alta esposizione alla TCDD, ad esempio in seguito 
ad incidenti industriali, si sono stimati valori pari a 96-7000 ng TEQ/Kg di 
peso corporeo (Roeder R.A. et al.,1998). Nel 1998 il WHO ha stabilito che 
la dose tollerabile assumibile giornalmente (TDI=tolerably daily intake)
1
 è 1-
4 pg TEQ/Kg/giorno. Ad oggi, l’assunzione media di tali sostanze nella 
popolazione di vari Paesi è da considerarsi al di sotto del TDI; in particolare, 
negli adulti di molti Paesi l’assunzione media va da 0,33 a 3,57 pg 
TEQ/Kg/giorno, inferiore quindi al massimo TDI (Kokichi Arisawa et al., 
2005). 
 Le diossine non erano presenti nell’ambiente prima dell’industrializzazione 
se non in piccole quantità dovute alla naturale combustione e ai processi 
geologici (Czuczwa J.M. et al., 1985; Shecter A. et al., 1988; Ferrario J. and 
Byrne C., 2000). Oggi questi composti si ritrovano in tutti gli esseri umani, 
con livelli più alti nelle persone che vivono nei paesi più industrializzati 
(Shecter A. and Gasiewicz T.A., 2003) che risultano esposti a bassi livelli di 
PCDDs/PCDFs attraverso il cibo, l’acqua, l’atmosfera ed il suolo e non solo 
a seguito di esposizione accidentale o dovuta al lavoro in siti a rischio 
(Kokichi Arisawa et al., 2005). Le diossine vengono rilasciate nell’aria per 
poi ricadere come ceneri. Quando un animale mangia del cibo contaminato 
introduce queste sostanze nella catena alimentare. E’ stato stimato che il 
90% dell’esposizione umana alla TCDD proviene dall’alimentazione: la fonte 
principale è rappresentata da animali che sono esposti primariamente alle 
                                                 
1
 La TDI  definisce la quantità massima assumibile giornalmente, di una sostanza tossica senza 
provocare lo sviluppo di effetti dannosi per la salute, con una esposizione continua nell’arco della vita. 
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emissioni di TCDD che si depositano sulla superficie del suolo, delle piante 
e dell’acqua. L’uomo assume  poi la TCDD attraverso il consumo di carne, 
latte, pesce e uova. Questo determina un’esposizione continua a bassi livelli 
di TCDD che, a lungo andare, si accumula nell’organismo determinando 
effetti dannosi per la salute (Svensson B. et al., 1991). Le diossine sono 
composti biologicamente ed ambientalmente persistenti: basti pensare che 
l’emivita della più tossica delle diossine, ovvero la TCDD, nei roditori è di 
circa 2-4 settimane (Rose J.Q. et al., 1976; Olie K., 1980), ma nell’uomo è 
stata stimata un’emivita di 7-11 anni, sia pure con  notevoli variazioni 
individuali (Pirkle J.L.et al., 1989). Recenti studi di farmacocinetica hanno 
dimostrato che l’emivita della diossina è dose-dipendente e inoltre varia in 
base alla composizione del corpo: una maggiore presenza di tessuto 
adiposo determina infatti un aumento dell’ accumulo e quindi una maggiore 
persistenza (Emond C. et al., 2005; Aylward L.L. et al., 2005). Ciò è dovuto  
alla natura lipofilica della TCDD, che ne permette il passaggio senza 
ostacoli attraverso le membrane cellulari e il deposito in vari organi, in 
particolare nel tessuto adiposo e nel fegato (Kokichi Arisawa et al., 2005). 
Altre diossine possone essere eliminate più o meno rapidamente, infatti 
alcune PCDF hanno meno di 6 mesi di emivita, per altre invece si è 
misurato un tempo di eliminazione pari a 20 anni (Schecter A. et al., 1990a; 
Ryan J.J. et al., 1993; Flesch-Janys D. et al., 1995; Ogura L., 2004). 
Durante la guerra del Vietnam, tra il 1962 e il 1970, è stata ampiamente 
utilizzata, come defoliante, una miscela 1:1 di acido 2,4-
diclorofenossiacetico e acido 2,4,5-triclorofenossiacetico detta Agent 
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Orange contenente da 2 a 30 ppm di TCDD (ATSDR, 1998). Negli studi 
condotti su alcuni veterani americani, che furono esposti all’Agent Orange si 
sono riscontrati livelli di TCDD nei lipidi sierici superiori a 600 ppt, parecchi 
anni dopo aver lasciato il Vietnam, mentre i livelli di TCDD riscontrati nella 
popolazione non esposta non superavano 1-2 ppt (Kahn P.G. et al., 1988; 
Shecter A. et al.,1990a, 1992; Michalek J.E. et al., 1995). In Vietnam, i livelli 
di diossina riscontrati nel suolo delle aree contaminate dall’Agent Orange 
sono superiori a 1000000 ppt, dopo oltre 30 anni dalle operazioni militari 
americane con il defoliante; inoltre elevati livelli di diossina sono stati 
misurati nel cibo e negli stessi vietnamiti che vivevano nelle aree colpite 
(Schecter A. et al., 2001a, 2002, 2003). I PCDFs e PCDs furono coinvolti 
nell’avvelenamento dell’olio di riso in Giappone nel 1968 (Masuda Y., 2003) 
e, per lo stesso motivo a Taiwan nel 1979 (Rogan W.J. et al.,1988; Guo Y.L. 
et al., 2003). Famosa è stata la contaminazione da diossina avvenuta nel 
1976 a Seveso, in Italia a seguito dell’esplosione di un’industria chimica. In 
quella occasione si produssero alcuni chilogrammi di diossina che 
contaminò l’ambiente e fu responsabile della morte di numerose forme di 
vita sia della flora che della fauna circostante l’insediamento industriale. 
Benché un numero consistente di individui, sia adulti che bambini , fossero 
venuti a contatto con la sostanza chimica, per molti anni non si sono 
riscontrati effetti gravi sulla salute. Studi più recenti hanno tuttavia 
evidenziato un innalzamento dell’incidenza dei tumori nella popolazione che 
viveva nelle zone più esposte alla diossina sprigionata con l’esplosione 
(Bertazzi P.A. et al., 1989). Più recentemente la diossina è tornata alla 
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ribalta delle cronache per il caso di avvelenamento del Presidente ucraino 
Viktor Yushchenko nel 2004 (BBC, 2004; Chivers C.J., 2004; Fakelmann K., 
2004).  
In Europa, nell’ultimo secolo si è verificato un costante aumento 
dell’esposizione della popolazione a questi prodotti, che ha raggiunto un 
picco negli anni ‘50 e ‘60 per poi diminuire. Un secondo picco si è avuto 
negli anni ‘80-‘90, dovuto all’incremento dell’industria della carta e 
soprattutto delle emissioni poco controllate provenienti dagli inceneritori dei 
rifiuti.  
 
2. Struttura della Diossina e legame al recettore Arilico (AhR) 
La diossina e i composti ad essa correlati sono costituiti da due anelli 
benzenici connessi da 1 o 2 atomi di ossigeno e contenenti da 4 a 8 atomi 
di cloro, per un totale di più di 75 composti clorurati detti congeneri 
(Schecter A. et al., 2005). La struttura chimica della 2,3,7,8-
tetraclorodibenzo-p-diossina è la seguente: 
 
 
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Come è stato riportato nel paragrafo precedente, la più tossica tra tutti i 
composti appartenenti a questo gruppo è la 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-
diossina sulla quale si sono pertanto concentrati gli studi clinici ed 
epidemiologici degli ultimi 30 anni (U.S. Department of Health and Human 
Services 2000; Paustenbach D.J., 2002; Cole P. et al., 2003). 
E’ stato stabilito con certezza che, una volta attraversata la membrana 
citoplasmatica grazie alla sua alta lipofilicità, la diossina si lega ad una 
particolare proteina citosolica, conosciuta come recettore degli idrocarburi 
arilici o recettore arilico( AhR) (Bradfield C.A. et al., 1991). 
Questo recettore è un membro della famiglia delle proteine bHLH/PAS 
(basic helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim), noti regolatori trascrizionali, ed è 
coinvolto nell’ organogenesi, nella detossificazione di endo- e xenobiotici e 
in diverse risposte organo-specifiche indotte dalla diossina. I tipici ligandi 
sono gli idrocarburi arilici (dai quali prende il nome), gli idrocarburi arilici 
alogenati come la diossina e numerosi costituenti vegetali introdotti con 
l’alimentazione. Non è ancora noto con certezza quale sia il ligando 
fisiologico del recettore arilico: fra le varie ipotesi avanzate a questo 
proposito si possono ricordare i metaboliti del triptofano (Denison M.S. and 
Nagy S.R., 2003) e, più recentemente, l’AMP ciclico (Oesch-Bartlomowicz 
B. et al., 2005). Il ruolo fisiologico del recettore arilico non è ancora 
pienamente compreso sebbene l’elevato livello di conservazione in una 
larga varietà di specie animali suggerisca un suo fondamentale ruolo per la 
fisiologia cellulare (Poellinger L., 2000).