La coltura in vitro di apici meristematici: la micropropagazione del carciofo "Spinoso sardo" come tecnica di risanamento e moltiplicazione in vitro di germoplasma infetto dal virus TSWV (Tomato-spotted-wilt-virus)

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RIASSUNTO 
In Sardegna lo stato sanitario del germoplasma di carciofo “Spinoso sardo” è 
ormai da parecchi anni compromesso da infezioni virali indotte da diversi 
virus, quali principalmente TSWV (tomato spotted wilt virus), ArLV 
(Artichoke latent virus) e AILV (Artichoke Italian latent virus) che 
compromettono dal punto di vista qualitativo e produttivo le carciofaie 
isolane. Non essendoci allo stato attuale nessuna strategia di lotta contro tali 
gli agenti infettivi, l’unica “arma” a favore degli agricoltori rimane quella della 
difesa chimica preventiva contro i principali vettori di tali virus.  
Una soluzione auspicabile potrebbe essere rappresentata dall’impiego di 
materiale risanato che andrebbe a costituire i nuovi impianti: a tal proposito 
la micropropagazione del carciofo “Spinoso sardo” si inserisce in questo 
contesto, riuscendo ad offrire una validissima alternativa alla lotta chimica 
preventiva e, attraverso la coltura in vitro di apici meristematici, ottenere 
germoplasma virus esente da utilizzare per l’impianto di nuove carciofaie. 
Da diversi anni l’Agenzia Regionale AGRIS Sardegna, in collaborazione con 
l’Agenzia LAORE, ha avviato diversi programmi di rinnovamento del 
germoplasma, mediante l’immissione e la cessione gratuita di materiale 
vegetale di cloni di carciofo, “Spinoso sardo” micropropagato, selezionato e 
risanato; attraverso i suoi laboratori e le sue aziende sperimentali ha quindi 
dato vita ad una massiva ed ampia diffusione nelle diverse zona cinaricole 
regionali.  
La presente tesi sperimentale si pone come obiettivo principale l’ottenimento 
di materiale vegetale risanato dal virus Tomato spotted wilt virus (TSWV), 
attraverso la coltura in vitro di apici meristematici di dimensioni inferiori a 
0,5 mm, condizione inderogabile ed essenziale per l’ottenimento di 
percentuali di risanamento accettabili.
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1 CAPITOLO – Introduzione 
 
1.1 Definizione della coltura in vitro  
Per coltura in vitro si intende l’applicazione biotecnologica in cui cellule, 
tessuti e organi sono coltivati in un ambiente sterile ed artificiale ed in 
condizioni chimico-fisiche controllate (1). Più specificamente in ambito 
vegetale, si intendono tutte quelle tecniche utilizzate in laboratorio per 
mantenere tessuti e organi vegetali in coltura sterile, intendendo tali attività 
come integrative e non alternative alle tecniche tradizionali di 
moltiplicazione agamica e clonale. 
Lo sviluppo della biologia molecolare di questi ultimi decenni è stato 
possibile grazie all’acquisizione delle conoscenze sugli organismi più 
semplici, come batteri virus e lieviti. È stato poi necessario e indispensabile 
verificare negli organismi superiori sia l’universalità di tali conoscenze, sia 
l’esistenza di nuovi meccanismi biologici, propri solo degli eucarioti 
superiori. 
La coltura di cellule e tessuti di piante (e di tutte le tecniche che ne derivano) 
trova il suo fondamento nella teoria della “totipotenza cellulare” (1). In tutte 
le piante vascolari l’embrione si evolve in una struttura allungata bipolare, 
per via della presenza di due meristemi apicali, quello caulinare (fusto) e 
quello radicale. Durante il ciclo vitale della pianta questi meristemi 
producono continuamente nuovi organi, come fogli, fusti o radici che vanno 
ad aggiungersi a quelli prodotti durante l’embriogenesi. Grazie al 
meccanismo di crescita illimitata le piante vascolari sono state definite 
organismi ad embriogenesi ricorrente o ontogenesi ricorrente. A causa di 
questa ontogenesi ricorrente, nelle piante, a differenza di quello che accade 
negli organismi animali, non si assiste alla separazione della linea somatica e 
della linea germinale; infatti solo ad un dato momento dello sviluppo, gli apici 
vegetativi si trasformeranno in apici riproduttivi, cioè in strutture atte alla 
riproduzione. Per questo principio importantissimo, ogni cellula somatica, 
nelle piante vascolari, può considerarsi potenzialmente un progenitore di un 
nuovo individuo.
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1.1.1 Cenni storici della coltura in vitro e stato dell’arte 
I padri e pionieri della coltura in vitro furono gli scienziati M. J. Schleiden e T. 
Schuann nel 1838, che con la loro “teoria cellulare” (1), identificarono nella 
cellula, l’unità presente in tutti gli esseri viventi, sia vegetali e sia animali. Gli 
albori della tecnica delle colture in vitro, nei vegetali, ebbe inizio nei primi 
anni del 1900, con la pubblicazione di “Experiments on the culture of isolated 
plant cells” (1902) ad opera di Gottlieb Haberlandt il quale, basandosi sul 
concetto di totipotenza, riprese e ampliò la teoria cellulare formulata da 
Schwann e Schleiden 60 anni prima, riuscendo a mantenere in vita numerosi 
tipi di tessuti vegetali per diversi giorni, senza ottenere divisione cellulare. In 
particolare egli prese come materiale di partenza cellule del tessuto a 
palizzata di Laminum purpureum e di Eichoria crassipes, l’epidermide di 
Ornithogalum (Liliacee) e peli epidermici Pulmonaria mollissima 
(Boraginacee), facendoli crescere in una soluzione di Sali di Knop e 
saccarosio, annotando le seguenti osservazioni: una crescita di cellule con 
parete sottile e maggior volume, la comparsa di amido nei cloroplasti, 
nessuna divisione cellulare. Solo molti anni dopo White nel 1934, coltivando 
radici di pomodoro e utilizzando un terreno contenente sali, estratto di 
lievito e saccarosio, osservò degli abbozzi di divisioni cellulari; egli scoprì che 
l’estratto poteva essere sostituito da tre vitamine del gruppo B: tiamina, 
piridossina e acido nicotinico, grazie a questa intuizione mantenne i suoi 
estratti radicali in coltura per molti anni. Nel 1935 Gautheret in Francia e 
White negli USA nel 1938, riuscirono ad ottenere la divisione di cellule isolate 
da Salix e da tabacco e infine mantenere delle colture cellulari 
indefinitamente. La ragione era l’utilizzo dell’acido indol-3-acetico (IAA), un 
ormone regolatore di crescita, della famiglia delle auxine, che permetteva la 
crescita di un tessuto indifferenziato sulle superfici di taglio sterilizzate, 
questo tessuto fu definito “callo”. Tale tessuto era in apparenza identico a 
quello generato inizialmente per mitosi, sulle superfici di taglio. 
Successivamente fu provato che il callo poteva essere propagato (secondo 
particolari condizioni), in modo indefinito. Sulla superficie di taglio quindi, le 
cellule inizialmente si dividono attivamente e in modo sincrono; dopo 4-6 
settimane di continue divisioni cellulari, l’espianto produce all’incirca il
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doppio in peso di tessuto calloso, rispetto a quello originario.  Il tessuto 
calloso da questo momento  può essere rigenerato in una nuova coltura. Il 
processo di crescita del callo può essere certamente considerato un processo 
di de-differenziamento, come è stato dimostrato dalle variazioni nella 
morfologia e nel metabolismo cellulare. È perciò possibile, variando le 
condizioni di coltura, indurre il ri-differenziamento del callo in tessuti 
specializzati, fino a riprodurre l’intera pianta. 
Nel 1951 F. Skoog e Tsui dimostrarono che l’aggiunta di adenina e di alti 
livelli di fosfato in colture di tabacco, inducevano la crescita del callo e la 
formazione di gemme; questa intuizione culminò nel 1957, quando Skoog e 
Miller dimostrarono che la 6 furfurilamminopurina, una citochinina isolata 
da DNA idrolizzato, poteva indurre il differenziamento in cauli, dei calli 
indifferenziati; inoltre il rapporto citochinina/auxina era in grado di 
differenziare diversi programmi morfologici da cellule di callo: un rapporto 
superiore a 1 induceva la formazione di fusti, un rapporto inferiore a uno 
induceva la formazione di radici. Nel 1958 la totipotenza cellulare fu 
dimostrata da Steward il cui gruppo di ricerca fu il primo a trasformare delle 
linee cellulari di carota in embrioni, che più tardi furono detti embrioni 
somatici. Tornando indietro nel tempo, nell’anno 1949, vennero poste invece 
le basi del risanamento in vitro, partendo da materiale vegetale infetto da 
virosi. In base a tal proposito, lo scienziato Ball osservò in vari esperimenti 
che il meristema apicale di una pianta infettata da un virus (cioè la piccola 
massa di cellule indifferenziate, con una dimensione inferiore al decimo di 
millimetro, situata all'estremità dello stelo o del fusto, che cresce 
costantemente ed origina gli organi della pianta) era, quasi indenne. Questa 
scoperta rivoluzionò il mercato delle piante ornamentali, in particolare 
dell’orchidea, visto che si poté effettuare il risanamento ma allo stesso tempo 
ottenere milioni di piante. 
Nei decenni successivi l’uso delle colture di cellule, protoplasti e tessuti e 
delle tecniche di ricombinazione genetica, ha permesso di creare nuove 
varietà utilizzando i meccanismi molecolari e cellulari che sono alla base 
della diversità biologica. Sul piano metodologico si tratta di una scorciatoia 
considerevole e nello stesso tempo di una grande scommessa. Essa offre
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anche la possibilità di accrescere la variabilità genetica che è seriamente 
diminuita in seguito alla distruzione dell’habitat delle specie selvatiche e che 
rende alcune specie e varietà coltivate molto vulnerabili agli agenti patogeni 
ed ai parassiti. A fianco dei centri di conservazione del germoplasma, le 
colture di cellule e di tessuti ed il controllo di milioni di linee cellulari 
saranno sempre più dei fattori essenziali della variabilità e della diversità 
genetica. 
Da oltre 60 anni in Italia la micropropagazione è considerata una tecnica di 
propagazione vegetativa innovativa (2), da affiancare alle tradizionali 
tecniche di propagazione agamica 
; ciò ha reso possibile che il nostro paese sia tra i maggiori produttori di 
piante propagate in vitro (2). Negli anni 2000 e in particolare nel 2006 è stato 
condotto un censimento in Italia, al fine di quantificare le piante prodotte con 
questa tecnica. Da questo censimento è stata stimata una produzione di 25 
mln di piante propagate con la tecnica della micropropagazione. Di questi 25 
mln risultava che oltre il 60% della produzione era relativa al comparto 
frutticolo (2). Di recente molti laboratori (commerciali privati e/o di 
istituzioni pubbliche), hanno sviluppato la micropropagazione di un’ampia 
gamma di specie da frutto e ornamentali (2); inoltre altri laboratori hanno 
proposto nuove realtà produttive quali quelle del carciofo (AGRIS per lo 
“Spinoso sardo” e il Violetto di Provenza). Questo ha dato e sta dando un 
notevole impulso allo sviluppo della coltura in vitro, riflettendosi nel numero  
maggiore di capitali (privati e pubblici) investiti nel settore, arrivando cosi ad 
una maggiore diversificazione dell’offerta e alla produzione di un prodotto 
avente standard qualitativi elevatissimi. 
1.2 Cenni storici, botanica e coltivazione del carciofo 
Il carciofo è una pianta diploide a 34 cromosomi (2n=2x=34), allogama a 
causa di una spiccata proterandria. La specie presenta un’elevata eterozigosi 
che caratterizza le cultivar attualmente coltivate (popolazioni costituite da 
mescolanze di cloni) e che si manifesta nelle discendenze propagate per seme 
con una grande variabilità morfologica e fisiologica (3).
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Il carciofo, il cui nome botanico è Cynara scolymus L., appartiene alla famiglia 
delle Composite ed è una pianta poliennale, coltivata prevalentemente nel 
bacino del Mediterraneo. Deriva dalla pianta araba denominata “Kharsuf” che 
significa cardo commestibile e notizie del suo consumo alimentare si fanno 
risalire agli antichi egizi; cenni storici del suo utilizzo sono rintracciabili in 
epoca greca e romana. Già nel 300 a.C. Teostratto, nella sua “Storia delle 
piante”, descriveva le caratteristiche e le virtù del carciofo nell’isola di 
Trinacria, mentre Plinio “il vecchio” (I° secolo d.C.) ne documenta il suo uso 
nella cucina romana, nel suo scritto “Naturale historia” (3). Il massimo 
esperto dell’epoca, il celebre Apicio, parla in particolare dei cuori di carciofo 
nel “Dere conquista”, il trattato considerato come codice alimentare 
dell’antica Roma (3). Notizie più certe della sua coltivazione risalgono al XV° 
secolo, quando venne introdotta da Filippo Strozzi nella zona di Napoli, per 
poi diffondersi in toscana e altre regioni d’Italia. La stessa Caterina de Medici 
fu una grande consumatrice (3). 
La coltivazione del carciofo in Sardegna e in particolare della tipologia 
“Spinoso sardo”, è di antica tradizione, anche se non si hanno notizie certe 
sulla sua introduzione e successiva diffusione nell’isola. A tal proposito, vi è 
una testimonianza scritta della sua presenza nel trattato “Agricoltura di 
Sardegna” (1780), del nobile sassarese Andrea Manca dell’Arca che 
testualmente riporta: “sono i carciofi e cardi grati allo stomaco, onde si 
reputa il cardo una delle piante più utili dell’orto (3). In Sardegna è l’essere 
pianta e il carciofo fiore e frutto che ella produce”. La coltivazione vera e 
propria la si può comunque datare intorno al 1920 soprattutto nelle zone 
costiere del sassarese e del cagliaritano, dove la presenza di porti favoriva i 
collegamenti ed i commerci con la penisola. A titolo informativo, nella figura 
1.1, vengono riportati i dati ISTAT del 1929, relativi alle superfici e alle 
produzioni di carciofo nelle regioni italiane (3).