2
Le infezioni fungine nell’uomo vengono suddivise in:
- micosi superficiali, causate da dermatofiti, che colonizzano
la cute, i capelli e le unghie; spesso, queste micosi hanno
andamento cronico e presentano resistenza alla terapia,
anche se comunque non compromettono lo stato di salute
generale del paziente;
- micosi profonde o sistemiche, causate da organismi che
vivono allo stato libero in natura come saprofiti del suolo
(spore dell’Aspergillus fumigatus) o appartengono al gruppo
dei microrganismi commensali nell’uomo (Candida
albicans), capaci di provocare lesioni sistemiche in pazienti
immunocompromessi, in quanto questo tipo di micosi
implica trasporto per via ematica con localizzazioni diverse
a seconda degli organi o apparati colpiti (miocarditi,
osteomieliti, artriti, endooftalmiti, cistiti). (1).
L’incidenza di infezioni fungine sistemiche è aumentata
significativamente durante gli ultimi dieci anni. Questo
aumento è dovuto a diversi fattori quali : ampio utilizzo di
antibiotici a largo-spettro, agenti immunosoppressivi,
alimentazione parenterale e utilizzo di cateteri venosi, cure
intensive di neonati prematuri, trapianto d’organi, e, infine,
l’epidemia della sindrome di immunodeficienza acquisita
(AIDS). La Candida è il secondo agente eziologico isolato negli
ospedali in pazienti immunocompromessi, secondo solo allo
Stafilococco coagulasi-negativo.
Secondo studi recenti, candidemie nosocomiali al giorno
d’oggi rendono conto del 10-15% di tutte le infezioni sanguigne
acquisite negli ospedali. Si registrano casi di candidosi
sistemiche fin nel 10% di tutti i neonati sottopeso (<1kg).
La mortalità per infezioni fungine profonde è ancora molto
alta: dal 30% nei casi di candidemia al 50% nelle aspergillosi
sistemiche, fino al 75% nei casi di infezioni da zigomiceti. La
candidosi rimane sicuramente l’infezione tuttora più frequente,
negli anni, però, si è osservato un cambiamento epidemiologico
caratterizzato dalle diverse incidenze nelle varie specie di
Candida (Fig.1.1). Inoltre, alcuni funghi, in precedenza ritenuti
contaminanti o innocui colonizzanti, sono stati recentemente
identificati come cause di gravi infezioni nei pazienti
immunocompromessi.
Figura 1.1: Incidenza delle infezioni causate da Candida spp. in pazienti
immunocompromessi.
L'incidenza delle infezioni da Aspergillus, invece, nelle varie
casistiche varia dal 10 al 30 %, ma nello stesso centro si
possono osservare notevoli variazioni a seconda dei periodi ed,
in particolare, essendo l'Aspergillus un comune contaminante
dei materiali biologici in decomposizione, in caso di opere di
costruzione o restauro all'interno o nei pressi dell'ospedale,
per la liberazione nell'aria di un elevato numero di spore
fungine (Fig.1.2).
3
Figura 1.2: Incidenza nei siti di infezione invasive causate da Aspergillus.
(Eur.J.Hematol.,1999)
Rilevanti terapie antifungine iniziarono nel 1903, con il
trionfante utilizzo dello ioduro di potassio (KI) nel trattamento
contro la sporotricosi. Negli anni seguenti non si registrarono
molti progressi fin quando nel 1951 non venne lanciata sul
mercato la nistatina, il primo poliene efficace. Questa fu presto
seguita dall’amfotericina B, nel 1956, considerata ancora oggi
lo standard rispetto al quale vengono confrontati le moderne
terapie antifungine. Fatta eccezione per lo sviluppo della
flucitosina (1964), non ci fu fino agli anni 70 sviluppo di nuovi
farmaci che vantavano come principio attivo gli azoli.
Gli ultimi decenni sono stati caratterizzati principalmente
dalla modificazione, mediante tecniche di High-throughput
screening, della molecola di base degli azoli, portando alla
nascita del miconazolo (1978), ketoconazolo (1981), fluconazolo
(1990) e itraconazolo (1992), che possono essere somministrati
oralmente e che sono dotati di maggior efficacia e minore
tossicità, allargando anche lo spettro di azione.
4
5
1.2 IL MERCATO EMERGENTE DELLE TERAPIE ANTIFUNGINE
Il mercato di antifungini utilizzati per infezioni sistemiche è
cresciuto notevolmente dal 1999 in poi, aumentando il suo
valore da 2 mila milioni di dollari a 3 mila milioni nel 2003:
questa dilagante crescita è dovuta ad un’aumentata severità e
incidenza delle infezioni antifungine invasive combinate al
lancio sul mercato di nuovi prodotti antifungini;comunque, si
pensa che continuerà così fino al 2014
(www.leaddiscovery.co.uk/reports/Antifungals).
Sebbene gli azoli abbiano dominato fino ad ora il mercato dei
farmaci antifungini, rappresentando il 52% delle vendite totali
nel 2003, ci si aspetta che la nuova classe delle echinocandine,
tra cui il Cancidas
®
, diventi quella predominante: già solo nel
2003, poco dopo il loro lancio sul mercato, la loro vendita ha
raggiunto il 22%, percentuale che, quindi, svela una buona
accettazione da parte dei pazienti sottoposti a terapie
antifungine.
Attualmente, gli antifungini in generale rappresentano più del
6% dell’intero mercato mondiale di agenti anti-infettivi e, con il
20% di espansione annuale, si suppone che essi
raggiungeranno un valore di 15 mila milioni di dollari nel giro
dei prossimi dieci anni (1).
1.3 LA CLASSIFICAZIONE DEGLI ANTIFUNGINI
Un antifungino ideale dovrebbe possedere le seguenti
caratteristiche:
- potente attività fungicida;
- specificità di target;
- sinergia positiva con altri farmaci;
- assenza di resistenza;
- effetti collaterali trascurabili o del tutto assenti in terapie.
6
Oggi sono usati due diversi gruppi di farmaci: 1) quelli
prodotti da diversi organismi e 2) quelli prodotti mediante
sintesi. Nel primo gruppo, solo l’amfotericina B è efficace in
diverse micosi profonde sistemiche. Sebbene la sua tossicità ne
limiti l’uso, l’amfotericina B è tuttora il farmaco più scelto. Il
secondo gruppo è costituito dai farmaci sintetici, inclusi la
flucitosina e gli azoli. Tra gli azoli ci sono gli imidazoli e la
nuova generazione della famiglia dei triazoli, itraconazolo e
fluconazolo.
L’amfotericina B resta, comunque, la terapia più efficace
nella maggiorparte delle micosi anche se ad essa sono associati
molti effetti collaterali, tra cui nefrotossicità, resistenza e
scarsa biodisponibilità se somministrata oralmente in terapie a
lungo termine in pazienti immunocompromessi. La flucitosina
non è efficace se usata singolarmente, quindi è usata solo in
combinazione con amfotericina B e fluconazolo. Il ketoconazolo
è disponibile per somministrazione orale per infezioni
sistemiche e rappresenta una terapia valida in candidosi
orofaringee. L’itraconazolo è un nuovo antifungino triazolico
con una farmacocinetica migliore del ketoconazolo, ed è
attualmente il farmaco di scelta in alcune micosi endemiche,
utile anche in alcune micosi opportunistiche profonde. Anche il
fluconazolo, nuovo antifungino triazolico, è caratterizzato da
profili farmacocinetici migliori e minor effetti collaterali tra
tutti gli antifungini sintetici disponibili oggi. Esso rappresenta
sia una prima terapia per la cura di alcune infezioni profonde
da Candida spp. o criptococco in ospiti immunocompetenti e
anche immunocompromessi, sia una semplice terapia di
mantenimento contro queste infezioni.
Quindi, altre importanti considerazioni nella selezione di
farmaci includono:
- spettro di attività;
- efficacia nella deduzione di una responso clinico e di una
cura;
7
- facilità di somministrazione;
- grado di effetti collaterali (1).
1.3.1 Polieni
Il meccanismo d’azione dei macrolidi polienici prevede
l’interazione selettiva di questa classe di antibiotici con gli
ergosteroli, ovvero gli steroli della membrana cellulare dei
funghi (diversi dal colesterolo delle cellule dei mammiferi):
questa interazione causa indebolimento della membrana ( che
non espleta più come deve la sua funzione di barriera),
cambiamenti nella sua permeabilità, rilascio dei componenti
cellulari, soppressione dei processi metabolici e, quindi, morte
della cellula.
1.3.1.1 Amfotericina B
L’amfotericina B venne introdotta nel 1956 e da allora è
rimasto il miglior farmaco antifungino, in quanto unico agente
sistemico disponibile per diversi anni, nonostante la sua alta
tossicità. È stata isolata dal processo fermentativo di
Streptomyces nodosus, un attinomicete del suolo.
Effetti secondari attribuibili all’amfotericina B sono anche
danni cellulari causati dall’ossidazione del farmaco.
Dal punto di vista farmacologico, l’amfotericina B è
scarsamente assorbita oralmente, meno del 5% di
biodisponibilità, quindi è necessario somministrarla via
endovena per assicurare un’adeguata concentrazione nel siero.
Il suo spettro d’attività è piuttosto ampio, comprendendo
diverse specie di funghi e anche lieviti e forme filamentose. È
stato dimostrato che però esistono alcuni casi di tolleranza in
alcune specie di Candida, come per esempio nella C. albicans.
Invece, si registrano attività variabile nei confronti di
8
Aspergillus, e resistenza in C.lusitaniae e Trichosporon beigelii
(1).
1.3.1.2 Amfotericina B liposomale
È stato dimostrato che incapsulando l’amfotericina B in
vescicole liposomali o unendola insieme a carrier lipidici si
ottiene una notevole riduzione nella tossicità, quindi un grado
di tollerabilità decisamente superiore, e un possibile aumento
di effetto terapeutico di questo farmaco. Così alla luce di
questi promettenti risultati clinici, sono stati sviluppati tre
composti industriali derivati: AmBisome, Amphocil (
Amphotericin B Colloidal Dispersion, ABCD) e Amphotericin B
Lipid Coplex ( ABLC, Abelcet). Queste tre diverse formulazioni
differiscono significativamente sia in composizione che in
farmacocinetica; inoltre, tutti e tre hanno in comune una
considerevole riduzione della nefrotossicità. Comunque, questi
composti sono raccomandati solo in casi di intolleranza o di
fallimento della terapia convenzionale con amfotericina B.
Nel 1995 è stato approvato dalla Food & Drug Administration
l’uso della ABLC in pazienti affetti da aspergillosi invasiva,
insensibili o intolleranti al trattamento convenzionale con
amfotericina B.
Inoltre, l’amfotericina B liposomale sembra essere sicura,
efficace e ben tollerata anche in neonati sottopeso (1).
1.3.1.3 Nistatina
La nistatina è stato il primo agente antifungino introdotto in
usi clinici. È stato isolato da un attinomicete, Streptomyces
noursei, che produce due antifungini, l’actidione e la nistatina.
La maggiorparte dei funghi patogeni sono inibiti in vitro a
concentazioni di nistatina pari a 1,5-13 µg/ml (2).
9
1.3.1.4 Pimaricina
Isolata dallo Strepromyces natalensis, è usata principalmente
per curare candidosi e aspergillosi polmonari. Ha attività
particolarmente efficace nelle infezioni da Fusarium spp (2).
1.3.2 Flucitosina
La flucitosina è una fluorina analoga della citosina: essa,
infatti, viene trasportata nelle cellule fungine dove viene
deaminata dalla citosina deaminasi a 5-fluorouracile. Questa
conversione è assolutamente necessaria affinchè risulti attiva,
come inibitore della sintesi di DNA/RNA. Scoperta la sua
azione antifungina nel 1964, oggi questo farmaco è utile
soprattutto in combinazione con l’amfotericina B nei
trattamenti di diverse micosi profonde. Il suo spettro di attività
è limitato alle candidosi, criptococcosi e chromomicosi, e,
purtroppo, è soggetta a resistenza sia congenita che acquisita
durante terapie prolungate.
La flucitosina è controindicata durante la gravidanza a causa
del suo effetto teratogeno, nei ratti (1,2).
1.3.3 Azoli
Gli azoli interferiscono con la biosintesi degli steroli e di altri
componenti lipidici della membrana, compromettendone,
quindi, l’integrità. Essi inibiscono la 14,α-dimetilasi, enzima
citocromo P-450 dipendente, responsabile della conversione del
lanosterolo in ergosterolo, principale componente della
membrana cellulare dei funghi. Ciò causa un aumento della
permeabilità e una progressiva instabilità.
Essi si dividono ulteriormente in imidazoli e triazoli (1,2).
10
1.3.3.1 Gli imidazoli
Gli imidazoli sono attivi contro una grande varità di funghi
patogeni, come Microsporum, Cryptococcus neoformans,
Candida spp., Coccidioides immitis etc. A basse concentrazioni
gli imidazoli agiscono come fungistatici, mentre ad alte come
fungicidi.
Il miconazolo è un imidazolo sintetico con un ampio spettro di
attività, che però non risulta attivo contro alcune specie di
Aspergillus e ficomiceti.
Il ketoconazolo, meno costoso, risulta meno tollerato sia del
fluconazolo che dell’itraconazolo (classe dei triazoli), con effetti
tossici più importanti, incluse epatiti e inibizioni della sintesi
di ormoni steroidei. Tutti e tre questi farmaci sono efficaci
alternative all’amfotericina B e alla flucitosina in casi di
particolari micosi sistemiche. Il ketoconazolo è efficace contro
numerosi funghi patogeni, fatta eccezione per C.tropicalis e
Aspergillus spp (1,2).
1.3.3.2 I triazoli
Appartengono a questo sottogruppo, il fluconazolo e
l’itraconazolo.
Il fluconazolo sembra essere ben tollerato, dal momento che
gli effetti collaterali risultano abbondantemente ridotti nei
pazienti. Il suo utilizzo, largamente diffuso per curare infezioni
fungine, ha contribuito però ad un significante aumento di
infezioni da C. krusei. Studi sperimentali hanno mostrato che
in genere C. krusei è meno virulenta della C. albicans, in
termini di aderenza sia alle cellule epiteliali sia a superfici
prostetiche. Comunque, la risposta globale a questo farmaco,
confrontata con quella all’amfotericina B, è simile (66% vs
64%); inoltre, gli effetti collaterali sono sicuramente più
frequenti nei pazienti trattati con amfotericina B.
11
L’itraconazolo fu approvato nel 1992 per curare istoplasmosi
e blastomicosi polmonari ed extra-polmonari. Uno dei suoi
grandi vantaggi è la sua efficace attività contro aspergillosi, e
anche contro altri funghi patogeni (1,2).
1.3.4 Allilammine
La Naftifina è un nuovo composto membro di una nuova
classe di antimicotici, attivi contro una ampio range di funghi
patogeni. L’attività è particolarmente elevata e principalmente
fungicida, ma variabile nei confronti di lieviti e fungistatica
contro C.albicans e C.parapsilosis. La naftifina è un inibitore
specifico della squalene epossidasi fungina e mostra effetti
davvero scarsi contro gli enzimi epatici murini. Inoltre, le
allilammine influenzano indirettamente anche la biosintesi
degli acidi grassi e dei fosfolipidi, presumibilmente come
risultato di livelli alterati di squalene ed ergosterolo nelle
membrane cellulari: infatti, studi condotti su cellule trattate
con naftifina hanno confermato biosintesi della parete cellulare
difettiva (2).
1.3.5 Morfoline
L’amorolfina è un nuovo farmaco antifungino appartenente
alla famiglia dei fenil-propilpiperidine e morfoline derivati.
Attualmente è in fase di analisi clinica per uso in infezioni
umane. Il suo meccanismo d’azione prevede l’inibizione
dell’attività della C14-reduttasi e della C7-C8isomerasi, enzimi
chiave del pathway biosintetico degli ergosteroli. Questo
comporta l’indebolimento della parete. Purtroppo, il farmaco
non mostra attività rilevante in micosi sistemiche dopo
somministrazione per via orale. Questa scarsa attività è
12
probabilmente dovuta al rapido metabolismo del farmaco,
ipotesi fatta osservando i modelli animali (2).
1.3.6 Nuovi farmaci antifungini
Nuovi farmaci antifungini sono stati ottenuti mediante uno
screening di prodotti naturali e di composti sintetici, seguiti da
ottimizzazione del cosiddetto “best lead compound”, mediante
chimica combinatoriale e High-throughput screening. Gli
pneumocandinici sono, ad esempio, potenti agenti antifungini
in via di sviluppo per uso in terapie antimicotiche a largo
spettro (2).
Echinocandine
Agenti fungicidi con bassa tossicità ma buona efficacia anche
contro organismi finora resistenti agli altri farmaci, come
Pneumocystis carinii, che infetta animali: questo
microrganismo, recentemente riclassificato come fungo
patogeno, è la maggior causa di morte nei pazienti affetti dal
virus dell’HIV nel nord America e in Europa, nonostante
l’avvento della terapie retrovirali (3). Dal punto di vista
strutturale, essi sono dei lipopeptidi ciclici semisintetici,
scoperti nel 1970, tra cui pneumocandina Ao, echinocandina
B-C-D, cilofungina LY280949 e papulocandina; essi sono tutti
inibitori non competitivi della sintesi dei glucani di parete,
capaci di legarsi a diversi siti della β-(1,3)- glucanosintasi.
Uno degli ultimi farmaci appartenente a questa classe
lanciato su mercato è il CANCIDAS
®
(Caspofungin acetato):
sintetizzato a partire da un prodotto della fermentazione di
Glarea iozoyensis, il Cancidas è indicato per curare pazienti
affetti da neutropenia causata da infezioni fungine e per curare
candidosi e aspergillosi in pazienti refrattari alle terapie
classiche. Infatti, questo farmaco di nuova generazione sembra
avere effetti molto più efficaci dell’AmBisome o
13
dell’amfotericina B, abbassando l’incidenza di effetti collaterali
causati da terapia dal 55% circa al 25%. Inoltre, il Cancidas è
l’unico agente che mostra attività contro alcune specie di
Aspergillus sia in vivo che in vitro (4).
Nikkomicina
Le poliossine e le correlate nikkomicine sono antibiotici
prodotti dagli streptomiceti e scoperti tra gli anni ’60 e ’70.
Essi rappresentano una nuova potente classe di agenti
antifungini diretti contro la sintesi della chitina: agiscono,
infatti, come inibitori competitivi del substrato UDP-N-
acetilglucosammina (2).
In C.albicans sono stati isolati tre geni implicati nella
espressione di tre chitina sintasi diverse, CHS1, CHS2 e CHS3:
la chitina sintasi Chs1 è responsabile della produzione di
chitina nel setto primario, la chitina sintasi Chs2 è espressa
preferenzialmente nelle forme ifali, la Chs3 è responsabile
della produzione di chitina nella “bud scar”. Questi tre enzimi
sono ridondanti, come anche in Saccharomyces cerevisiae (vedi
paragrafo 2.2 introduzione), lievito modello nel quale doppi
mutanti in almeno due di questi geni sono vitali solo in certe
condizioni. Ridondanza ancora maggiore è stata riscontrata in
A.fumigatus, in cui ci sono sette chitina sintasi diverse (3).
Sfortunatamente, i composti che sono in efficaci in vitro non lo
sono necessariamente anche in vivo: questo probabilmente a
causa del fatto che esistono diverse isoforme della chitina
sintasi, che influenzano così l’efficacia di un farmaco. Ceppi di
S.cerevisiae esprimenti solo la Chs3 si sono dimostrati più
sensibili alla nikkomicina Z, a differenza di ceppi esprimenti
solo la Chs2. Questo, quindi, ha fatto ipotizzare che la chitina
sintasi Chs3 è un buon target per questo tipo di agente
antifungino(5).
Oggi sono comunque ancora in corso studi che confermino
questi promettenti risultati, in quanto questi antifungini
hanno un’attività piuttosto limitata contro i funghi patogeni
umani, a causa di profili farmacocinetici sfavorevoli (2).
Sordarina
Nuova classe di agenti fungicidi, scoperti dalla Glaxo-
Wellcome, che agiscono selettivamente contro la sintesi di
proteine del fungo, inibendo il fattore di allungamento della
traduzione EF2. Per ora, comunque, pare che i funghi
filamentosi siano meno suscettibili in vitro a questo farmaco
rispetto ai lieviti (1,2,6).
1,3-βglucansynthase, major enzyme for fungal cell
wall synthesis
Tabella 1.1: Tabella riassuntiva degli agenti antifungini e dei loro
target molecolari.(Ind.J.Chest Diseases,2000).
14
15
1.4 INIBITORI DELLE VIE DI SOPRAVVIVENZA CELLULARE: NUOVO
FRONTE DI RICERCA
Recentemente è emerso che l’elevata capacità di lieviti e
funghi di tollerare stress di parete o di membrana è dovuta a
vie di segnalazione essenziali che la cellula utilizza per riuscire
a sopravvivere. Infatti, l’assenza di geni codificanti per enzimi
di parete è spesso causa di gravi fenotipi che però non
determinano letalità, in quanto questi organismi attivano una
complessa risposta cellulare per compensare i danni prodotti
nella parete e per prevenire la lisi. Il “cell wall salvage
pathway” è un fenomeno adattativo che si basa da un lato
sull’esistenza di proteine che compensano i difetti
nell’assemblaggio della parete, dall’altro su vie di trasduzione
del segnale attivate dai danni alla parete da parte di proteina
sensori di membrana. Strategie terapeutiche prevedono,
quindi, di utilizzare combinazioni di inibitori diretti sia contro
specifici target di parete rappresentati da enzimi, sia contro
componenti delle vie di salvataggio (7,8,9,10).
Uno di questi pathway è la via della calcineurina, una
fosfatasi specifica per fosfo-serina o treonina,
calcio/calmodulina dipendente, che defosforila un fattore
trascrizionale (Crz1p), il quale trasloca nel nucleo e attiva la
trascrizione di quei geni richiesti per la sopravvivenza.
È stato dimostrato che inibitori della via della calcineurina
potenziano l’azione degli azoli (11). Immunosoppressivi come la
ciclosporina A (CsA) e l’antibiotico FK506 inibiscono la via
della calcineurina e bloccano l’attivazione delle cellule T,
responsabili del rigetto nei trapianti. La CsA e FK506 sono
tossici per numerosi funghi, purtroppo però tra questi non è
presente la Candida albicans. Comunque, usando una
combinazione di CsA, FK506 e fluconazolo sembra che si riesca
a perturbare la sintesi dell’ergosterolo di membrana, grazie ad
un’attività fungicida sinergica.
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