Induzione di plasticità sinaptica nel circuito cerebellare in vivo

1 
1. INTRODUZIONE 
 
 
Il sistema nervoso è in grado di elaborare una grande quantità di informazioni 
provenienti dal mondo esterno. Il flusso dell’informazione generato dall’attivazione dei 
recettori sensoriali guida il segnale attraverso il sistema somatosensoriale. In particolare, il 
controllo sensori-motorio è di importanza fondamentale per stabilire una corretta relazione tra 
l’organismo e l’ambiente. Una struttura di notevole rilievo in tal senso è il cervelletto. 
Nonostante gli effetti della lesione cerebellare siano noti da tempo e numerosi modelli teorici 
siano stati proposti per spiegarne il funzionamento, i meccanismi operativi della rete 
cerebellare rimangono tuttora largamente sconosciuti. La corteccia cerebellare presenta due 
regioni ben definite: lo strato granulare, e quello molecolare e delle cellule del Purkinje. Lo 
strato granulare riceve l’afferenza dalle fibre muscoidi che eccitano le cellule granulari e le 
cellule del Golgi. Queste ultime inibiscono i granuli mediante circuiti a feedforward e a 
feedback. Recentemente, notevoli progressi sono stati compiuti nel campo della fisiologia 
cellulare mostrando in modo sempre più preciso la funzione di singolo neuroni e sinapsi. 
Tuttavia, si sente ora l’esigenza di riportare tali conoscenze ad un contesto funzionale più 
ampio mediante registrazioni nel cervelletto in vivo. 
Un utile modello per studiare la codificazione e trasmissione dei segnali nervosi è 
l’animale anestetizzato, dove è preservata l’integrità del circuito neurale. In particolare, sono 
state utilizzate la stimolazione tattile faciale e quella elettrica intracerebellare nel ratto in vivo, 
simultaneamente a registrazioni dal cervelletto stesso. 
Sono state studiate per esteso le risposte caratteristiche dello strato granulare alla 
stimolazione tattile negli emisferi cerebellari di ratti anestetizzati. È ben noto che una regione 
del cervelletto, la Crus IIa, riceve una grande quantità di input afferenti dalla zona periorale e 
dai baffi. Registrazioni focali da tale area mostrano una risposta evocata dalla stimolazione 
sensoriale di tipo tattile che deriva principalmente dall’attivazione di due vie nervose: quella 
trigeminale e quella corticale (Morissette and Bower, 1996). 
Recentemente, è stato scoperto che l’attivazione delle fibre muscoidi evocata dalla 
stimolazione tattile induce treni di potenziali di azione (spike burst) nelle cellule granulari 
(Chadderton et al., 2004). Inoltre è stato dimostrato che, in vitro, l’attivazione delle fibre 
muscoidi mediante un pattern di stimolo tipo theta-burst, unitamente alla depolarizzazione
2 
postsinaptica, determina LTP (long term potentiation) delle correnti postsinaptiche eccitatorie 
(EPSCs, excitatory postsynaptic currents) nelle cellule granulari. Lo strato dei granuli è 
dotato dunque di forme di plasticità a lungo termine che consentono l’apprendimento e la 
deposizione di memoria. Il meccanismo di espressione della plasticità è tale per cui esso 
stesso determinerebbe modifiche complesse della trasformazione temporale dei segnali in 
ingresso. 
Nella prima parte del presente lavoro, è stata caratterizzata la risposta generata dalla 
stimolazione tattile: sono state identificate le componenti di origine trigeminale e corticale, 
già precedentemente descritte (Morissette and Bower, 1996), ed è stata trovata una terza 
“onda”, ritardata, mai riportata in passato, probabilmente derivante da loop polisinaptici. È 
stato quindi deciso di adottare una stimolazione sensoriale alla frequenza theta (TSS, theta-
frequency sensory stimulation) per indurre plasticità alla sinapsi tra fibra muscoide e cellula 
granulare in vivo. Sono stati dunque indagati gli effetti a lungo termine di TSS in differenti 
condizioni sperimentali: in assenza di farmaci; in presenza di gabazina, bloccante dei recettori 
GABAA, aggiunto prima del TSS; in presenza di D-APV, bloccante dei recettori NMDA, e 
gabazina insieme, aggiunti prima del TSS; in presenza di 5-HT (serotonina), un modulatore 
dell’apprendimento, aggiunto prima del TSS. Nella seconda parte di questo lavoro, si è 
praticata la stimolazione elettrica intracerebellare per avere conferma che l’effettivo sito di 
plasticità fosse la Crus IIa e non altre regioni correlate di tale circuito neurale. Detti 
esperimenti confermano l’esistenza, nello strato granulare del cervelletto, di una forma di 
plasticità NMDA-dipendente che può essere indotta da stimoli naturali in vivo. 
 
 
 
Il presente lavoro di tesi è inserito nei progetti CEREBELLUM (http://www.cerebellum.org) 
e SPIKEFORCE (http://www.spikeforce.org) della Comunità Europea, e nell’ambito del 
progetto FIRB-NEUROSCIENCE del MIUR coordinati dal Prof. Egidio D’Angelo.
3 
2. L’INFORMAZIONE SENSORIALE 
 
 
L’informazione fluisce all’interno del sistema nervoso secondo una modalità di tipo 
feedforward tale per cui dai recettori sensoriali che captano lo stimolo essa passa attraverso il 
tronco encefalico e i nuclei talamici fino a giungere alla corteccia cerebrale. Questa 
organizzazione permette successive trasformazioni dell’informazione sensoriale e la 
generazione di rappresentazioni interne (Ahissar and Kleinfeld, 2003). Un simile compito è 
difficile perché la capacità di un singolo neurone di trasportare un segnale è piccola, mentre la 
quantità di dati che l’intero sistema nervoso gestisce è enorme. Il sistema somatosensoriale 
risolve tale problema “spezzando” ciascun evento sensoriale in modalità ben definite che sono 
portate avanti in vie specifiche per ogni singola modalità. 
 
 
2.1 MECCANISMI PERIFERICI DI SENSAZIONE SOMATICA 
Il sistema somatosensoriale assolve a numerosi compiti, i quali possono essere 
sommariamente suddivisi in tre categorie: 
1. funzioni esterocettive: comprendono le sensazioni tattili, termiche e dolorifiche, e 
forniscono informazioni circa stimoli ambientali; 
2. funzioni propriocettive: includono la cinestesia (senso di posizione e movimento); 
3. funzioni enterocettive: nascono dai recettori sensoriali negli organi interni e danno 
informazioni circa la salute e il buon funzionamento dei visceri. 
Ognuna delle generiche modalità somatosensoriali viene suddivisa in “sottomodalità”. 
Così, per esempio, la meccanocezione comprende il tatto fine, l’estensione della pelle, urti e 
vibrazioni. In generale, una “sottomodalità” può essere definita come la sensazione prodotta 
quando viene attivato un singolo assone sensoriale primario. Tale aspetto mostra i principi 
della specificità recettoriale e della segregazione delle modalità sensoriali: di conseguenza, un 
singolo recettore produce attività lungo un pathway ben definito di neuroni nel sistema 
nervoso centrale (SNC). Il flusso di informazione così prodotto permette all’organismo di 
determinare accuratamente sia il tipo di stimolo che la sua localizzazione. 
Studi morfologici ed elettrofisiologici hanno permesso di mettere in evidenza tre grandi 
classi di recettori: i meccanorecettori che rispondono a stimolazioni di tipo meccanico (tatto e
4 
cinestesia), i termorecettori che rispondono a stimolazioni termiche, e i nocicettori che 
rispondono a stimoli ambientali potenzialmente nocivi e sono responsabili del dolore. 
Nonostante la possibilità di classificare piuttosto nettamente i vari tipi di recettori, la classe 
dei meccanocettori risponde anche a stimoli di natura chimica o termica, tuttavia tale risposta 
viene eliminata a livello di fibre afferenti superiori. 
 
2.1.1 Meccanocettori: struttura e funzione 
La superficie corporea è ricoperta da pelle pelosa e pelle glabra, dove sono incorporati 
sette tipi di meccanocettori responsabili del rilevamento di stimoli meccanici lievi. I 
meccanocettori hanno un’alta sensitività alla penetrazione, alla pressione sulla pelle o al 
movimento dei peli. Al centro delle funzioni di ciascun meccanocettore vi è la capacità di 
trasdurre un particolare stimolo meccanico in un segnale elettrico, inteso come variazione del 
potenziale di membrana (trasduzione meccano-elettrica). Ciò che differenzia i vari tipi di 
recettori e ciò che li rende estremamente selettivi nei confronti di un’unica tipologia di 
stimolo sono la posizione nella pelle e la forma della capsula che circonda il terminale 
assonico. Infatti, gran parte della selettività per una specifica “sottomodalità” ascrivibile a tali 
recettori cutanei è una conseguenza diretta della loro struttura: si può parlare di una 
correlazione morfo-funzionale. 
La trasduzione di stimoli meccanici in attività neuronale ha inizio attraverso sette 
recettori periferici ben caratterizzati, alcuni dei quali occupano regioni superficiali della pelle 
(recettori cutanei), mentre altri tessuti più profondi (meccanocettori profondi). A prescindere 
dalla localizzazione, essi possono essere distinti in due tipi fondamentali in base al tipo di 
risposta (fig. 1): meccanocettori ad adattamento rapido (RA, rapidly adapting) e 
meccanocettori ad adattamento lento (SA, slowly adapting). Ognuna delle classi è divisa in 
sottoclassi secondo lo schema seguente:
5 
2.1.1.1 Recettori di tipo RA 
I recettori RA sono eccitati dal movimento della pelle e ne codificano la velocità nella 
frequenza di scarica. Se viene fornito alla pelle uno stimolo a rampa seguito da uno stimolo 
costante (fig. 1), essi rispondono solo durante il movimento e non quando la pelle è mantenuta 
costante nella nuova posizione. A una velocità costante di penetrazione le unità afferenti RA 
scaricano un treno di impulsi a frequenza proporzionale alla velocità di spostamento. Questa 
relazione viene approssimata bene da una relazione di potenza della forma: 
R   =   a  S
b
, 
dove R è la risposta, S è l’intensità dello stimolo e a e b sono costanti empiriche. I recettori di 
questo tipo sono presenti nella pelle con peli e nella pelle glabra. Essi includono diverse 
specie di recettori che possono essere suddivisi in due sottoclassi: RA1 che reagiscono meglio 
a stimoli di velocità e RA2 che reagiscono meglio a stimoli di accelerazione. 
 
 
Fig. 1 – Rappresentazione delle scariche neurali nelle fibre dei meccanocettori. a) Andamento dello stimolo continuo. b) 
Risposta dei meccanocettori RA. c) Risposta dei meccanocettori SA. d) Risposta in frequenza per RA e SA. 
 
• I corpuscoli di Pacini sono una speciale classe RA2 e sono situati negli strati più profondi 
della pelle glabra e di quella con peli. Essi hanno una struttura a forma di piccola perla 
grigia formata da tessuto non nervoso, lamellata e simile a una cipolla; la loro lunghezza 
varia tra 0.5 e 2 mm e contengono al centro un terminale nervoso allungato (fig. 2). La 
fibra afferente è mielinata, con l’ultimo nodo di Ranvier incapsulato nel recettore. La 
terminazione del nervo ha una sezione trasversale ovoidale, contiene un array 
circonferenziale di mitocondri e un abbondante reticolo di microtubuli posizionato sotto 
la membrana del recettore. Le afferenze di Pacini operano agli estremi della funzione 
sensoriale essendo molto sensibile a vibrazioni piccolissime della pelle, con una soglia di
6 
10 nm a 200 Hz, e sono perciò responsabili della percezione di vibrazioni ad alta 
frequenza, con campi recettivi molto vasti. 
 
 
Fig. 2 – Sezione longitudinale di un corpuscolo di Pacini. 
 
• I corpuscoli di Meissner (fig. 3) sono recettori RA1 incapsulati con una fibra afferente 
mielinata. Sono situati nel derma della pelle glabra dell’uomo, ripiegati nelle papille 
dermiche che riempiono le scanalature nella pelle. La capsula è formata da diversi strati 
distinti di tessuto nervoso. Le terminazioni nervose sono formate da lamine avvolte a 
elica lungo l’asse del corpuscolo separate da cellule di Schwann. Le fibre di collagene 
collegano la metà distale del recettore all’epidermide sovrapposta, la quale è modificata 
strutturalmente per permettere un legame meccanico effettivo capace di trasmettere i 
movimenti alle terminazioni nervose nel recettore. Il corpuscolo di Meissner è un 
meccanocettore sensibile alla velocità e quindi scarica impulsi solo durante il movimento 
della pelle. Il range effettivo di frequenza di uno stimolo vibratorio percepibile da questo 
recettore è compreso tra i 10 e i 200 Hz. 
 
 
Fig. 3 – Disegno dei corpuscoli di Meissner.
7 
• I corpuscoli di Krause esistono in due varietà, cilindriche e globulari, si trovano anche 
nella pelle glabra e sono maggiormente comuni nei mammiferi non primati. Il loro assone 
termina nella capsula semplicemente lamellata del recettore con disposizione lineare nella 
varietà cilindrica e a spirale nella varietà globulare. I recettori di Krause venivano 
considerati erroneamente recettori del freddo, in realtà si è dimostrato che sono recettori 
tattili rilevatori di velocità (RA1), infatti sono maggiormente sensibili a un range di 
frequenze superiore ai 10 – 100 Hz e non danno risposte a una pressione mantenuta 
stabilmente sulla pelle. 
• I recettori del follicolo pilifero sono innervati da fibre afferenti mielinate che terminano in 
un complesso di terminazioni organizzate circonferenzialmente intorno alla guaina della 
radice del pelo sotto le ghiandole sebacee. Queste terminazioni hanno forma di bastone 
avvolto a elica intorno al pelo, sono chiuse in cellule di Schwann e sono in contatto da 
una parte con la membrana basale della radice del pelo, dall’altra con il collagene (fig. 4). 
Le unità afferenti del follicolo pilifero sono meccanocettori RA1, scaricano impulsi solo 
quando il pelo viene mosso e possono segnalare l’ampiezza, l’entità e la direzione dello 
spostamento meccanico sia ad alte che basse frequenze. Ne esistono vari tipi che 
differiscono in sensitività, velocità di scarica e grandezza del campo recettivo (tipi D, G, 
T). 
 
 
Fig. 4 – Sezione trasversale di un follicolo pilifero. Si osservano le fibre nervose disposte a raggiera. 
 
2.1.1.2 Recettori di tipo SA 
I recettori SA sono meccanocettori di posizione, come i rilevatori di velocità rispondono 
durante lo spostamento della pelle, ma in aggiunta sostengono una scarica di impulsi quando 
la pelle è mantenuta in una nuova posizione (fig. 1). In contrasto con i recettori RA possono 
fornire una informazione circa i cambiamenti a lungo termine nelle condizioni meccaniche 
nella pelle. Durante il plateau della pressione in figura 1, la velocità di scarica diminuisce fino
8 
a raggiungere un valore caratteristico per ogni recettore SA proporzionale all’ammontare della 
pressione stessa. Ancora una volta questo soddisfa una funzione di potenza: 
R   =   a  S
b
, 
dove R è la risposta, S è l’intensità dello stimolo e a e b sono costanti empiriche, così che i 
recettori SA possono codificare lo stimolo come una frequenza di scarica. Ci sono tre tipi di 
meccanocettori ad adattamento lento: SA1 e SA2 (con assoni mielinati) e i meccanocettori C 
(con assoni non mielinati). Le unità SA1 sono normalmente silenti in assenza di uno stimolo 
meccanico applicato, mentre producono impulsi con andamento irregolare se la superficie 
della pelle è accarezzata rapidamente. Le SA2, al contrario, portano spesso una scarica di 
riposo tra 2 e 20 impulsi al secondo, sono facilmente eccitate dall’allungamento della pelle e 
producono impulsi con andamento regolare. La frequenza della risposta dei recettori SA a una 
deformazione mantenuta stabilmente può essere aumentata raffreddando la pelle, tuttavia la 
risposta dinamica rimane solo pochi secondi, a differenza di quella dei termorecettori la cui 
scarica dinamica continua per un minuto. Questo effetto della temperatura della pelle sulle 
risposte dei recettori SA spiega l’illusione di Weber, cioè l’osservazione che oggetti freddi 
sembrano più pesanti di oggetti caldi dello stesso peso. 
• Le cellule di Merkel e le terminazioni nervose associate (fig. 5) formano un recettore 
SA1. Le cellule di Merkel sono alla base della epidermide, hanno nuclei con molti lobi, 
contengono cospicue vescicole granulari dalla parte del derma e piccole proiezioni come 
bastoni (microvilli) sulla superficie epidermica. Alla base di ogni cellula di Merkel 
l’assone mielinato sensorio forma un’espansione a forma di disco, chiamato disco di 
Merkel. Sono responsabili della percezione della tessitura degli oggetti. 
 
 
Fig. 5 – Rappresentazione della disposizione delle cellule di Merkel (a sinistra) e di un disco di Merkel (a destra).