Il sistema visivo del Danio rerio come modello di studio per malattie congenite umane: induzione di ciclopia e studio immunoistochimico.

Negli ultimi anni sono stati realizzati molti studi rivolti all’approfondimento
dei meccanismi cellulari e molecolari che governano i processi dello sviluppo del 
sistema visivo del Danio rerio (Ciprinide Teleosteo). Questa specie presenta molti 
vantaggi come modello sperimentale: facilità di riproduzione controllata, 
trasparenza degli embrioni durante tutto lo sviluppo embrionale, e possibilità di 
mutagenesi diretta. Attualmente il Pesce Zebra si utilizza ampiamente come 
modello sperimentale per lo studio di meccanismi genetici alla base di patologie 
umane congenite (Dooley e Zon, 2000); ciò è dovuto al fatto che molti dei 
fenotipi, ottenuti mediante mutagenesi diretta, simulano diverse anomalie che si 
manifestano durante lo sviluppo umano. La ciclopia compare non solo in animali 
come il Pesce Zebra, ma anche nell’uomo che manifesta una sindrome chiamata 
oloprosencefalia. Infatti la somministrazione di etanolo al 2,4 %, ad embrioni del 
Danio rerio, nel periodo compreso tra gli stadi di blastula tardiva e di gastrula 
primordiale, per un tempo di 3 ore, induce ciclopia (Sander e Baumann, 1983; 
Blader e Strähle, 1998). Sin dagli esperimenti pionieri di Stockard (1910), la 
ciclopia è stata riscontrata nei Pesci, come fenomeno di mutazione dovuto alla
presenza di etanolo nel corso dello sviluppo embrionale. Simili effetti dell’etanolo 
sono stati osservati in altri Vertebrati. Inoltre questa sostanza sembra essere 
quella, che più di ogni altra, induce ciclopia nell’uomo (Cohen e Sulik, 1992; 
Johnston e Bronsky, 1995). Questa anomalia può presentarsi sotto diverse forme, 
ovvero dalla parziale fusione degli occhi (Fig. 1.1 B,C), all’esistenza vera e 
propria di un unico occhio (Fig. 1.1 D,E).
Fig. 1.1 Il trattamento con etanolo causa ciclopia. Gli embrioni allo stadio 
intermedio dome/30% epiboly, sono stati trattati con una soluzione di etanolo al 2.4 %, 
per tre ore e lasciati crescere fino allo stadio di 48 hpf. A Embrione non trattato 
(controllo). B,C Embrioni trattati in cui si nota una parziale fusione degli occhi. D,E
Embrioni trattati che presentano ciclopia completa (Tratto da Blader e Strähle, 1998).
I mutanti cyclops e one-eye-pinhead presentano occhi che non subiscono 
migrazione ma si mantengono fusi in posizione centrale ed inoltre mancano della 
porzione ventrale dell’encefalo anteriore; questo difetto è conosciuto con il nome 
di oloprosencefalia (Solnica-Krezel et al., 1996). L’oloprosencefalia si manifesta 
come il risultato di un’anomalia nella differenziazione del prosencefalo negli 
emisferi cerebrali e nei ventricoli laterali, nel periodo compreso tra la quarta e 
l’ottava settimana di gestazione (De Meyer, 1987; Babcok, 1986; Filly, Chin e 
Callen, 1984).
L’esposizione di embrioni umani ad etanolo, nelle tappe iniziali dello 
sviluppo, produce un effetto teratogeno (sindrome alcolica fetale) inducendo, nella
differenziazione iniziale del sistema nervoso, gravi alterazioni, tra cui
l’oloprosencefalia (Sulik e Johnston, 1982; Cohen e Sulik, 1992; Johnston e 
Bronsky, 1995). In questa anomalia rara gli occhi si fondono in maniera parziale o 
totale formando un occhio mediale racchiuso in un’unica orbita (Fig. 1.2). Si 
osserva solitamente una narice tubolare sopra l’occhio anormale. La ciclopia 
(occhio unico) e la sinoftalmia (fusione degli occhi) rappresentano un gamma di
difetti oculari nella quale si sono fusi parzialmente o totalmente gli occhi. Queste 
gravi anomalie dell’occhio sono accompagnate da altri difetti craniocerebrali
incompatibili con la vita. La ciclopia sembra derivi dalla soppressione di strutture 
cerebrali mediali (oloprosencefalia) che si formano a partire dalla parte craniale 
della placca neurale (O’Rahilly e Müller, 1989). La ciclopia si trasmette con 
carattere ereditario recessivo (Moore Persaud, Embriologia Clinica, 1997). Questo 
effetto è stato riprodotto sperimentalmente in embrioni del Pesce Zebra (Blader e 
Strähle, 1998).
Fig. 1.2 Neonato maschio con ciclopia (sinoftalmia). La ciclopia (fusione degli 
occhi) è un’anomalia grave e rara della faccia e dell’occhio caratterizzata inoltre dalla 
presenza di un’appendice simile ad una proboscide sopra gli occhi. Non esistono le ossa 
facciali come le nasali e le etmoidi. (Tratto da Moore Persaud, Embriologia clinica,
1997).
Attualmente si conoscono solo dati preliminari riguardo ai fattori che 
mediano la comparsa della ciclopia indotta dall’etanolo nelle tappe iniziali dello 
sviluppo di questa specie. Quello che è certo è la comparsa di anomalie 
morfologiche e deficienze nell’espressione genica in porzioni concrete 
dell’encefalo ventrale, identiche a quelle che presentano i ceppi cyclops e one-eye-
pinhead (Strähle et al., 1997). Tuttavia non si conoscono ancora le modificazioni 
posteriori che subisce la via di connessione retino-tettale negli embrioni indotti
rispetto al riordinamento dei modelli di connessione.
Diversi casi di oloprosencefalia sono stati riscontrati come derivanti da 
mutazioni del gene umano sonic hedgehog. Cyclops produce segnali necessari per 
il corretto sviluppo del mesoendoderma che genera un tessuto (placca precordale) 
che modella l’encefalo ventrale anteriore e separa l’iniziale campo ottico negli 
occhi bilaterali.
Errori di questi processi portano ad un encefalo ridotto e alla ciclopia (occhi 
fusi); in ogni caso altre regioni cromosomiali che contengono geni non ancora 
identificati, producono difetti di nascita molto simili. Per questa ragione gli 
scienziati si sono impegnati a studiare più a fondo il preciso ruolo dell’equivalente 
umano del gene cyclops del Pesce Zebra nel modellamento del sistema nervoso 
durante lo sviluppo embrionale.
La via visiva dei Teleostei in animali adulti è ben studiata e conosciuta da un 
punto di vista morfologico, immunocitochimico e ultrastrutturale (Velasco et al.,
1995; Lillo et al., 1998), sia in condizioni normali che dopo la realizzazione di 
manipolazioni chirurgiche. Queste manipolazioni provocano l’integrazione di
meccanismi neuronali e extraneuronali, come le modificazioni nella popolazione 
gliale e nel mezzo extracellulare, implicate nella riorganizzazione della
connessione retino-tettale (Stuermer, 1988; Velasco et al., 1997).
CAPITOLO II: IL SISTEMA VISIVO DEI 
TELEOSTEI
2.1 Ontogenesi del sistema visivo nei Teleostei
Il sistema visivo è l’unica via sensoriale che è integrata completamente nel 
sistema nervoso centrale (Fig. 2.1). È costituito da una struttura altamente
organizzata denominata retina. Questa, quando viene eccitata dalla luce, invia
l’informazione visiva a diversi centri encefalici attraverso il nervo ottico e i tratti 
ottici. In questi centri, che sono localizzati nel mesencefalo, nel diencefalo e 
nell’ipotalamo, l’informazione viene processata e integrata.
Fig. 2.1 Schema del percorso dell’informazione visiva dagli occhi fino al cervello 
in visione ventrale, nell’uomo. (Tratto da Montalenti, Biologia, Sansoni 1973).
La retina presenta una struttura organizzata in strati cellulari con sei tipi 
differenti di neuroni (Fig. 2.2). La sua organizzazione strutturale e la sua diversità 
cellulare fanno sì che la retina sia un modello molto utile per studiare il 
processamento dell’informazione in altri circuiti del SNC meno conosciuti. 
Fig. 2.2 Struttura della retina. La stimolazione dei fotorecettori da parte della luce 
viene trasmessa, mediante degli interneuroni, alle cellule gangliari, che inviano il 
segnale al cervello. (Tratto da Alberts, Biologia molecolare della cellula, Zanichelli 
1995).
Nel corso dello sviluppo embrionale, le proiezioni delle cellule gangliari
della retina attraversano diversi tessuti prima di arrivare ai loro centri specifici 
(nell’ipotalamo, nel diencefalo e nel mesencefalo), e ciò costituisce un ottimo 
modello di studio delle interazioni tra neuroni, cellule gliali e matrice cellulare.
Inoltre il fenomeno della proliferazione cellulare, presente sia nella retina 
(Muller, 1952; Lyall, 1957; Johns e Easter, 1977) sia nel tetto ottico (Richter,
1966;Kirsche, 1967;Meyer, 1978) dei Teleostei e per tutto il corso della loro vita, 
è di speciale interesse in neurobiologia.
2.1.1 Sviluppo del tubo neurale
La morfogenesi del sistema nervoso è un processo complesso che si svolge 
mediante la stessa sequenza di tappe in tutti gli embrioni dei Vertebrati (Land e 
Fernald, 1992), nel quale intervengono due dei tre foglietti embrionali: il 
mesoderma e l’ectoderma; il primo induce cambiamenti morfologici nel secondo 
che può così differenziarsi fino a diventare tubo neurale.
Per facilitare la comprensione del processo, che porterà alla formazione del 
tubo neurale, possiamo dividerlo nelle seguenti tappe:
Organizzazione dei campi morfogenetici
Durante le tappe iniziali della segmentazione dell’embrione, un numero 
ristretto di blastomeri progenitori organizzeranno, nel corso dello sviluppo, tutti i 
derivati neurali (Hirose e Jacobson, 1979; Kimmel et al., 1991).
Gastrulazione
É il processo che determina il riordinamento delle cellule della blastula e che 
porta alla formazione di una seconda struttura, la gastrula, in cui si possono 
distinguere i tre foglietti embrionali: endoderma, mesoderma e ectoderma. È stata 
quindi stabilita la corrispondenza tra la posizione che occupa una cellula al 
principio della gastrulazione con il tipo di tessuto che darà la sua discendenza
(Kimmel et al., 1990). Il foglietto ectodermico, indotto dal mesoderma, sarà
l’incaricato a formare i differenti tipi cellulari che costituiranno il SNC.
Induzione neurale dell’ectoderma
L’induzione neurale dell’ectoderma è un fenomeno che avviene in risposta a 
segnali della notocorda mesodermica sottostante (Spemann, 1938). Dall’ 
ectoderma derivano l’epidermide e il Sistema Nervoso Centrale. Durante la 
gastrulazione, le cellule ectodermiche esprimono il fattore trascrizionale BMP-4,
che provoca l’espressione di un gruppo di geni che inducono la formazione 
dell’epidermide (Holley et al., 1995; De Robertis e Sasai, 1996). L’interazione tra
notocorda ed ectoderma induce l’espressione di fattori di induzione neurale che 
bloccano BMP-4, permettendo che alcune delle cellule ectodermiche si 
differenzino in tessuto neurale (Piccolo et al., 1996).
Neurulazione
Dopo l’induzione, le cellule ectodermiche acquisiscono competenza neurale 
formando la placca neurale, che è il primo abbozzo embrionale del SNC. 
L’interazione sequenziale delle differenti zone dell’ectoderma con il 
mesoderma porta alla regionalizzazione della placca neurale; all’interno di questa 
si stabilisce un gradiente di induzione che in seguito determinerà l’organizzazione 
anteroposteriore, dorsoventrale e mediolaterale del futuro Sistema Nervoso 
(Schmitz et al., 1993).
La neurulazione è quel processo morfogenetico che, a partire dalla placca 
neurale, forma il tubo neurale (Fig. 2.3); esistono due tipi di neurulazione, quella 
primaria e quella secondaria; nella primaria, il cordamesoderma, struttura che darà 
origine alla notocorda, induce l’ectoderma sovrastante a proliferare e ad
invaginarsi dando luogo ad un tubo vuoto (Schoenwolf, 1991); nella secondaria 
invece, l’ectoderma si ingrossa e forma la placca neurale, sebbene le
caretteristiche pieghe neurali, che formeranno il tubo neurale saldandosi tra loro, 
siano sostituite da una chiglia centrale, formatasi per successive mitosi delle 
cellule della placca neurale.
Nel caso della neurulazione secondaria, il canale centrale o neurocele, non si 
sviluppa come risultato del piegamento su se stessa della placca neurale primitiva, 
bensì si forma secondariamente all’interno del tessuto, a partire da un cordone di 
cellule (Hisaoka e Battle, 1958; Waterman e McCarty, 1977; Schmitz et al., 1993).
A seconda dei differenti gruppi di Vertebrati, varia il tipo di neurulazione 
(Schoenwolf e Smith, 1990).
Per esempio nei Pesci la neurulazione è esclusivamente secondaria 
(Miyayama e Fujimoto, 1977, Nakao e Ishizawa, 1984); la neurulazione non 
avviene simultaneamente lungo tutto l’asse longitudinale dell’embrione ma segue
un gradiente rostrocaudale.
L’interazione tra mesoderma ed ectoderma porta, oltre ad una polarità 
anteroposteriore e mediolaterale, alla formazione di un gradiente che dipende dalla 
distanza delle cellule con la linea mediana del tubo neurale; così, al costituirsi del 
tubo, si formeranno una serie di regioni longitudinali che si chiamano 
rispettivamente, dalla porzione dorsale a quella ventrale, placca superiore o del 
tetto, placca laterale alare, placca laterale basale (separate l’una dall’altra dal 
sulcus limitans) e placca inferiore o del suolo (Kuhlenbeck, 1973).
Fig. 2.3 Processo di neurulazione che porta alla formazione del tubo neurale A
Stadio di iniziale invaginazione del mesoderma lungo la linea primitiva. B Il mesoderma 
si è disposto tra l’ectoderma e l’endoderma di entrambi i lati, ma non presenta ancora 
differenziamenti. C Comparsa del celoma, che divide il mesoderma laterale in una parte 
esterna e una interna. Al centro la notocorda si è separata dal restante mesoderma e le 
pieghe neurali compaiono su entrambi i lati 8della doccia neurale. D Le pieghe neurali 
si sono saldate per formare il midollo spinale. (Tratto da Romer, Anatomia comparata 
dei vertebrati, S.E.S. 1986).