Il monitoraggio terapeutico dei farmaci immunosoppressori mediante cromatografia liquida interfacciata al separatore di massa accoppiato: confronto fra il sistema UPLC-MS/MS vs HPLC-MS/MS.

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CAPITOLO 1 
 
 
Introduzione 
 
 
1.1.  Immunosoppressori 
Gli immunosoppressori sono farmaci usati per il controllo di 
gravi manifestazioni allergiche, malattie autoimmuni e malattie 
correlate ai trapianti, in quanto modulano la risposta immunitaria. 
Alcuni farmaci presentano un effetto diffuso sul sistema immunitario, 
mentre altri agiscono su un specifico bersaglio; i farmaci ad azione 
aspecifica hanno una maggiore probabilità di causare effetti avversi, 
mentre l’efficacia dei farmaci specifici potrebbe risultare ridotta 
qualora la loro azione venisse in parte annullata da vie metaboliche 
alternative. 
Spesso, dunque, i protocolli terapeutici prevedono l’uso combinato di 
più farmaci allo scopo di minimizzare gli eventi avversi e di prevenire 
fenomeni di resistenza. Benché i protocolli terapeutici siano essenziali 
per consentire una corretta valutazione del paziente, i medici 
dovrebbero essere in grado di adattare il trattamento basandosi sulla 
valutazione continua degli effetti del farmaco, sul decorso della 
malattia e sulla risposta dei singoli pazienti. 
Sebbene alcuni degli immunosoppressori attualmente 
disponibili in commercio siano stati sviluppati per un uso oncologico o 
per la gestione dei pazienti trapiantati, per diminuire il fenomeno del 
rigetto, al momento sono note più di 80 malattie autoimmuni e alcune 
condizioni allergiche comuni in cui è possibile utilizzare tali farmaci.
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Gli immunosoppressori possono essere classificati in 
corticosteroidi, piccole molecole, antimetaboliti e proteine
(1)
. 
 Corticosteroidi
(2)
: rappresentano i farmaci 
immunosoppressori di elezione e possono essere utilizzati sia nella fase 
di induzione della terapia che in quella di mantenimento, inibendo 
l’espressione genica delle citochine. Classici steroidi impiegati sono il 
cortisolo, il prednisone ed il metil-prednisolone. Utilizzati in 
combinazione con i chemioterapici nella cura delle leucemie e dei 
linfomi, come tutti gli steroidi sono dotati di pesanti effetti collaterali 
quando usati in pazienti cronici. Vengono somministrati per via 
endovenosa, parenterale o anche orale; in dosi elevate                  
(metil–prednisolone 250–1000 mg/die per 1–3 giorni) evidenziano un 
effetto linfocitotossico, mentre a dosi più basse agiscono come 
immunosoppressori e antinfiammatori, limitando la produzione di 
citochine. Tali farmaci non vengono mai somministrati come       
mono–farmaco, infatti è preferibile associare due farmaci a basso 
dosaggio, che utilizzare una dose alta di un solo farmaco; con la prima 
scelta la probabilità di sviluppare effetti collaterali acuti si riduce 
sensibilmente e la comparsa di quelli cronici viene ritardata. Comunque 
la dose e la durata del trattamento dovranno essere stabilite in funzione 
della patologia. 
 Piccole Molecole
(2)
: 
a) inibitori della calcineurina, come la Ciclosporina–A (CsA) e il 
Tacrolimus (FK–506), 
b) farmaci ad attività antiproliferativa delle cellule T mediante 
inibizione di mTOR, come il Sirolimus (SIR) e l’Everolimus (EVE). 
I primi, bloccando la sintesi dell’interleuchina–2, prevengono 
l’attivazione dei linfociti T; proprio per questo motivo essi giocano un 
ruolo essenziale nella prevenzione del rigetto cellulare acuto degli 
organi trapiantati, nella psoriasi e nella sindrome degenerativa del rene 
(sindrome nefrotica). Vengono utilizzati nella terapia di molte patologie 
autoimmuni ad esclusione dell’artrite reumatoide in cui rivestono un 
ruolo di minore importanza. Il principale effetto avverso associato a 
questa classe di farmaci è la nefrotossicità e  l’uso cronico può
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contribuire alla comparsa di insufficienza renale, sia nei pazienti 
trapiantati che in quelli sani. Essi inoltre possono causare 
l’aggravamento di varie condizioni, quali ipertensione e iperlipidemia, 
determinando un profilo cardiovascolare sfavorevole e possono, infine, 
incrementare il rischio di diabete. I secondi, invece, sembrano essere 
associati ad un minor rischio di ipertensione e intolleranza al glucosio e, 
nonostante siano caratterizzati da una minore nefrotossicità rispetto agli 
inibitori della calcineurina, essi potrebbero potenziare la tossicità renale 
della ciclosporina; pertanto richiedono un monitoraggio costante della 
funzionalità renale. Il monitoraggio terapeutico di tali farmaci è 
essenziale a causa del rischio di effetti tossici quali anemia, leucopenia 
e trombocitopenia. 
 Antimetaboliti
(2)
: possono impedire la sintesi del DNA 
prevenendo l'utilizzazione dei nucleotidi adenilici–ATP e deossi–ATP 
(per esempio l’azatioprina), oppure possono agire come analogo 
dell'acido folico che impedisce la sintesi “de novo” delle purine e 
quindi del DNA (per esempio il metotrexato) o ancora, possono agire 
come antagonisti dell'enzima inosina monofosfato deidrogenasi 
(IMPDH), utile nella sintesi e nel recupero dei nucleotidi guanilici (per 
esempio l’acido micofenolico). Tutti gli antimetaboliti impiegati nella 
terapia dei tumori possono, però, determinare numerosi effetti 
collaterali specie a carico del sangue, del fegato e dell'apparato 
digerente. 
 Proteine
(2)
: gli anticorpi monoclonali antilinfociti 
(antitimociti) sono stati utilizzati in Australia fin dal 1960. Non è nuova 
la terapia ad alte dosi di immunoglobuline di tipo G (IgG) nella cura di 
linfomi prima dell'avvento della chemioterapia antineoplastica. L'effetto 
delle IgG ad alto dosaggio sarebbe quello di competere con il sistema 
immunitario, inibendo, per un effetto di massa, i linfociti B, produttrici 
delle Ig. È da qualche decennio, però, che è sorta una nuova classe di 
anticorpi con bersaglio putativo completamente diverso; questi sono gli 
anticorpi monoclonali e policlonali diretti contro i recettori delle 
citochine, soprattutto, le interleuchine (IL–1 e IL–2) ed il fattore di
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necrosi tumorale (TNF–α). Esempi di farmaci di questo genere sono 
cetuximab, infliximab, trastuzumab, ustekinumab ed adalimumab. 
Nella tabella I è riportato il prospetto dei principali farmaci 
immunosoppressori impiegati nelle patologie con risposta 
immunologica non controllata: 
Classe Farmacologica Meccanismo D’Azione 
corticosteroidi 
Prednisone 
Inibizione diretta dell’attività delle cellule 
linfocitarie 
Desametasone 
Betametasone 
Antibiotici 
Ciclosporina A Legano la calcineurina e bloccano l’azione dei 
linfociti T. Tacrolimus 
Sirolimus Non blocca la produzione di interleuchine, ma 
inibisce la risposta dei linfociti T alle citochine Everolimus 
Interferoni  
INFα Molteplici effetti immunologici (sia  
immunostimolanti che immunosoppressori) che 
vanno dall’attività antivirale, attivazione dei 
linfociti NK, attivazione dei macrofagi e 
inibizione della proliferazione cellulare 
INFβ 
INFγ 
Farmaci Biologici  
Infliximab Anticorpo monoclonale antagonista del TNF–α 
Etanercept Proteina chimerica antagonista del TNF–α 
 
Agenti Citotossici  
Azatioprina Antimetabolita antagonista delle purine 
Leflunomide Inibitore della sintesi delle pirimidine 
Metotrexato Inibitore degli enzimi necessari per la sintesi 
degli acidi nucleici 
Immunosoppressori di nuova generazione 
Mofetile Micofenolato 
Inibizione della sintesi delle purine 
Mizoribina 
Brequinario sodico Inibizione della sintesi delle pirimidine 
Tabella I – farmaci immunosoppressori impiegati nelle patologie con risposta 
immunologica non controllata 
 
Gli immunosoppressori vengono impiegati per controllare la 
reazione di rigetto e sono i principali responsabili del buon esito del 
trapianto, in quanto inibiscono selettivamente il rigetto dei tessuti 
trapiantati e nello stesso tempo evitano che il paziente diventi
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immunocompromesso. Infatti, l’introduzione di un allotrapianto, cioè il 
trapianto di un organo o tessuto da un individuo a un altro che non è 
geneticamente identico al primo, può evocare una risposta immunitaria, 
determinando il rigetto del tessuto trapiantato. 
Tuttavia, questi farmaci sopprimono le diverse reazioni immunologiche, 
e rendono così, le infezioni a decorso rapidamente ingravescente, la 
principale causa di morte nei riceventi di trapianto; inoltre, possono 
facilitare l’insorgenza di tumori maligni. 
I primi farmaci immunosoppressori non erano selettivi e, di 
solito, i pazienti morivano a causa di infezioni dovute alla soppressione 
sia del ramo umorale (anticorpo–mediato) sia di quello cellulo–mediato 
del sistema immunitario. Attualmente, l’approccio principale della 
terapia immunosoppressiva consiste nell’alterare la funzione dei 
linfociti o degli anticorpi contro le proteine immuni, utilizzando 
farmaci.
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La maggior parte dei farmaci immunosoppressori risulta 
efficace quando viene utilizzata nella fase induttiva della risposta 
immunitaria, attraverso la riduzione della proliferazione dei linfociti; 
alcuni invece sono in grado di inibire anche certi aspetti della fase 
effettrice. 
 
Figura 1 – Schema semplificato della fase di induzione e della fase effettrice 
dell’attivazione dei linfociti con i siti d’azione degli immunosoppressori 
 
I farmaci immunosoppressori possono anche essere classificati 
in base al loro meccanismo d’azione: 
 agenti che interferiscono con la produzione e l’azione delle 
citochine. 
 agenti che alterano il metabolismo cellulare, impedendo la 
proliferazione dei linfociti 
 anticorpi monoclonali e policlonali che bloccano le 
molecole di superficie delle cellule T. 
Le citochine sono proteine di segnale solubili e non specifiche 
per l’antigene, che legano i recettori di superficie di una molteplicità di 
cellule. Il termine citochine comprende le molecole note come
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interleuchine (IL), l’interferone α e γ (INF–α INF–γ), fattore di necrosi 
tumorale (TNF), fattori di trasformazione della crescita e fattori 
stimolanti le colonie. 
L’IL–2 è una molecola che stimola la proliferazione delle cellule T, 
helper, innescate dall’antigene, che in seguito producono ulteriore     
IL–2, INF–α e INF–γ. 
Citochine Effetti 
IL-1 Aumento dell’attività delle cellule NK 
Effetto chemiotassico su neutrofili e 
macrofagi 
IL-2 Induzione della proliferazione delle 
cellule T innescate dall’antigene 
Aumento dell’attività delle cellule NK 
INF-γ Aumento dell’attività dei macrofagi e 
delle cellule NK e della produzione di IgG 
Aumento dell’espressione delle molecole 
del Complesso Superiore di 
Istocompatibilità (MHC) 
INF-α Effetto citotossico sulle cellule tumorali 
Induzione della secrezione di citochine nella 
risposta infiammatoria 
Tabella II – Riepilogo degli effetti delle principali citochine 
Queste citochine insieme attivano le cellule natural killer 
(NK), i macrofagi e i linfociti T citotossici. Evidentemente, i farmaci 
che interferiscono con la produzione o con l’attività dell’IL-2, come nel 
caso della ciclosporina, attenueranno in modo significativo la risposta 
immunitaria e, in tal modo, ridurranno la reazione di rigetto del 
trapianto.
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I pazienti in terapia con farmaci immunosoppressori 
necessitano del monitoraggio terapeutico, TDM, a causa del ristretto 
indice terapeutico di questi. Per una corretta posologia, i farmacologi 
adottano  la cosiddetta l’area sotto la curva (AUC) che consiste nel 
misurare la concentrazione del farmaco, in sangue intero, dopo la 
somministrazione ad intervalli regolari fino all’eliminazione completa 
di questo. 
 
Figura 2 - Area sotto la curva concentrazione/tempo, cioè la quantità di principio 
attivo presente nel flusso ematico in un intervallo di tempo, dopo 
somministrazione di un farmaco. 
 
Il TDM degli immunosoppressori aiuta a realizzare una terapia efficace 
e ottimale, minimizzando la tossicità. Variazioni in concentrazione 
all’esterno dell’indice della finestra terapeutica possono portare a esiti 
clinici avversi: tossicità nel caso di concentrazioni troppo elevate o 
rigetto quando la concentrazione è troppo bassa
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