Il dosaggio dell'apolipoproteina E mediante nefelometria: controllo di qualità e significato diagnostico

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trovato nelle cellule parenchimali e non di numerosi tessuti umani, per 
esempio tessuto epatico, nervoso, renale, endotelio arterioso, e in alcune 
specie animali come cane, scimmia, ratto, coniglio 
(1, 10)
.   Non si può dare 
per scontato a priori che il ruolo e la funzione specifica dell’ApoE, in ogni 
tessuto umano e in ogni specie in cui viene prodotta, siano sempre gli 
stessi. Anzi, già Robert Mahley nel 1988, in un importante lavoro 
pubblicato su Science 
(1)
 al quale faccio ampio riferimento, in parte 
dimostrava e in parte ipotizzava almeno tre funzioni diverse dell’ApoE, in 
tessuti diversi, sebbene riconducibili ad un unico ruolo biologico: 
a) funzione “simil-endocrina” di regolazione del trasporto del 
colesterolo a livello sistemico, cioè dal fegato alla periferia e 
viceversa; 
b) funzione “simil-paracrina” di regolazione e controllo dell’utilizzo di 
riserve lipidiche (soprattutto colesterolo) a livello locale tissutale; 
c) funzione “simil-autocrina” di regolazione dell’immagazzinamento di 
lipidi all’interno della singola cellula e, come conseguenza, del 
metabolismo lipidico intracellulare. 
A queste tre funzioni principali aggiungeremo, per completezza, 
l’ipotesi di un meccanismo immunoregolatore dei linfociti coinvolgente 
lipoproteine contenenti ApoB o ApoE, di cui esistono alcune evidenze 
sperimentali ma si ignora completamente il significato 
(1)
. 
Se, quindi, dovessi riassumere in due parole il ruolo biologico 
complessivo dell’apolipoproteina E, stando ai risultati finora disponibili in 
letteratura, mi esprimerei nel senso di una funzione strutturale e regolatoria 
nell’ambito del metabolismo lipidico, sia al livello sistemico che cellulare, 
e indirettamente una funzione regolatoria della proliferazione e 
differenziazione cellulare, vista l’importanza dell’immagazzinamento e 
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ridistribuzione dei lipidi nel corso della rigenerazione tissutale. 
L’apolipoproteina E agisce come ligando per i recettori LDL e per i 
recettori dei remnant dei chilomicroni e VLDL 
(1, 2, 10, 11)
, contribuisce  a 
formare il “guscio” lipo-proteico delle VLDL, IDL e di una sottoclasse 
delle HDL 
(2, 5, 12)
, rappresenta una piccola frazione delle proteine libere 
plasmatiche 
(10)
, è in grado di legare debolmente lipidi neutri, fofolipidi e 
colesterolo libero per formare aggregati lipoproteici sempre più grandi e 
organizzati, sia nel fluido interstiziale che nel plasma 
(1)
, e promuove la 
proliferazione e il differenziamento di alcuni tipi cellulari collaborando o 
competendo con fattori di crescita ed ormoni 
(1)
. Si capisce allora la grande 
differenza concettuale tra il ruolo biologico, ma anche fisiopatologico, 
dell’ApoE e quello per esempio di una proteina come l’insulina (funzione 
specificamente regolatoria) o come l’elastina (funzione specificamente 
strutturale).  
Dal punto di vista biochimico l’apolipoproteina E, o meglio le sue 3 
isoforme principali (E2, E3, E4),  ha una struttura primaria costituita da una 
sequenza di 299 amminoacidi, resa nota per la prima volta da Rall e 
collaboratori 
(10)
  nel 1982 mediante sequenziamento amminoacidico 
diretto. La struttura secondaria consiste nel 62% di alfa-elica, 9% di 
struttura beta (beta sheet), 11%  di ripiegamento beta (beta turns) e 18% di 
struttura non ripetitiva (random coil); si noti che ampi tratti di alfa-elica 
hanno un andamento amfipatico, nel senso che i gruppi idrofobici dei 
residui si trovano tutti su un versante dell’elica mentre i gruppi idrofilici  
tutti sul versante opposto 
(10)
. Esiste un raggruppamento di cariche positive 
tra gli amminoacidi 134 e 158 e tale porzione di proteina è in grado di 
legare il recettore LDL e l’eparina 
(10)
. Ci sono evidenze sperimentali che 
anche la regione carbossi-terminale può essere un sito di legame per il 
 7
recettore corrispondente 
(10)
. Le tre isoforme dell’ApoE, indicate 
comunemente come E2, E3, E4 in quanto codificate dai tre alleli principali 
epsilon-2, epsilon-3 ed epsilon-4, differiscono una dall’altra per uno solo o 
due amminoacidi: ApoE2 ha le posizioni n.112 e n.158 occupate entrambe 
dalla cisteina, ApoE4 dall’arginina, mentre ApoE3 ha la cisteina in 
posizione n.112 e l’arginina in posizione n.158 
(1, 10, 11)
. Quindi 
l’apolipoproteina E4 ha due cariche positive in più rispetto alla E2, e una in 
più rispetto alla E3, perché l’amminoacido arginina, a pH fisiologico, ha il 
gruppo laterale facilmente ionizzabile mentre la cisteina no. Al contrario 
l’ApoE2 ha due gruppi reattivi -SH (sulfidrilici, propri della cisteina) che 
possono formare altrettanti ponti disolfuro S-S con altre proteine contenenti 
cisteina, mentre l'ApoE4 manca di questi due gruppi –SH liberi. Queste 
modeste differenze tra i prodotti di trascrizione dei tre principali alleli per 
l’ApoE sono alla base della possibilità di fenotipizzare l’ApoE plasmatica 
di un individuo, della diversa funzionalità in vitro ed in vivo  delle tre 
isoforme 
(10)
, e della ricerca di un “peso” genetico dell’ApoE da attribuire al 
rischio totale di incorrere nella cardiopatia ischemica a prescindere da altri 
fattori. 
Non è un caso che per l’apolipoproteina E si parla sempre di ‘isoforme’ 
e mai di ‘varianti strutturali’, che non sono mai state descritte. Una 
semplice elettroforesi non può mettere in evidenza, separandole, le tre 
isoforme dell’apolipoproteina E; invece l’isoelectric focusing 
bidimensionale, che prevede una prima separazione in base al punto 
isoelettrico dei polipeptidi seguita da una migrazione elettroforetica in 
direzione perpendicolare alla precedente, consente di fenotipizzare l’ApoE 
plasmatica di un individuo – cioè trovare quali e quante isoforme esso 
esprime – e , di conseguenza, risalire al genotipo 
(10, 11)
. Per esempio se il 
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risultato dell’analisi indica la presenza (nel plasma o in un derivato di 
VLDL isolate) delle isoforme E3 ed E4, essendovi un meccanismo di 
codominanza nell’espressione genica dell’ApoE 
(1)
, il genotipo sarà 
epsilon-3 / epsilon-4.  
L’apoproteina E viene secreta  come  glicoproteina (associata a residui 
di acido sialico)
 (1, 11)
 ma non rimane tale per tutta la sua vita biologica e in 
tutti i fluidi corporei; si sa per certo che la frazione plasmatica libera viene 
desialilata da specifici enzimi plasmatici 
(11)
. Ora l’isoelectric focusing 
bidimensionale basa la sua capacità separativa e risolutiva sul punto 
isoelettrico, la carica elettrica netta e il peso molecolare dei polipeptidi 
(12)
. 
E’ ovvio che tale tecnica può dare risultati equivoci se una parte del 
campione da analizzare presenta un certo grado di glicosilazione e, per 
giunta, non omogenea. Per ovviare a questi inconvenienti sono state messe 
a punto procedure pre-analitiche (come l’uso di neuraminidasi quale agente 
glicolitico) sicuramente funzionanti, ma poco pratiche e un po’ artificiose. 
Molti studi epidemiologici, ai quali anch’io ho fatto riferimento, si sono 
basati su questa tecnica per arrivare alla genotipizzazione dell’ApoE. Oggi 
molti laboratori preferiscono adottare una procedura di tipizzazione basata 
su tecniche di biologia molecolare. In linea di principio si tratta di una 
procedura semplice, anche se costosa: 
a) estrazione dell’RNA messaggero totale dalle cellule di un tessuto;    
b) uso della trascrittasi inversa e di primers specifici per il mRNA 
dell’ApoE, per sintetizzare un cDNA che non esiste in natura 
(perché il gene per l’ApoE è formato da esoni ed introni); c) 
esecuzione della PCR per amplificare questo cDNA dell’ApoE; d) 
corsa elettroforetica per separare tutti i tipi di cDNA (corrispondenti 
alle diverse isoforme della proteina) presenti nel prodotto della 
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PCR. In questo caso, se la tecnica è eseguita a regola d’arte e non si 
verificano errori accidentali, il risultato non è mai equivoco e 
permette di scoprire altre eventuali isoforme (o veri e propri geni 
mutanti) dell’apolipoproteina E. 
 
 10
 
Il ruolo fisiologico dell’apolipoproteina E nel metabolismo lipidico 
 
Vorrei focalizzare l’attenzione su alcuni punti ben noti del metabolismo 
lipidico umano,  lasciando per il momento da parte le questioni ancora 
aperte: 
a) la mucosa intestinale è sede di sintesi dei chilomicroni, a partire da 
trigliceridi e colesterolo esogeni, ma non di ApoE; i chilomicroni 
nascenti contengono ApoB-48, ApoA-I e ApoA-IV, mentre 
acquisiscono l’ApoE dalla frazione libera plasmatica e dalle altre 
lipoproteine 
(1, 12)
. 
b) Il fegato è il principale produttore di ApoE (dai 2/3 ai ¾ del totale 
prodotto dall’organismo) sia come frazione libera plasmatica che 
come costituente proteico delle VLDL 
(1, 12)
. 
c) Entrambe le classi lipoproteiche, chilomicroni e VLDL, sono 
sottoposte in circolo alla lipolisi e ad un cambiamento nella 
composizione lipidica ed apoproteica, ad opera di enzimi come la 
LPL, la lipasi epatica e la proteina trasportatrice degli esteri del 
colesterolo; i cosiddetti remnants dei chilomicroni e delle VLDL 
possono essere captati dalle cellule epatiche in virtù dell’interazione 
tra l’ApoE lipoproteica ed i recettori corrispondenti sulla superficie 
cellulare 
(2, 3, 5)
. 
d) Esistono almeno due tipi di recettori per i residui dei chilomicroni e 
delle VLDL a livello epatico: il recettore per i remnants legante 
l’ApoE e il recettore per le LDL legante l’ApoB-100 e l’ApoE quasi 
con la stessa affinità 
(1, 2, 12)
. 
 11
e) Le HDL nascenti sono lipoproteine piccole e discoidali, ricche di 
fosfolipidi e non contengono ApoE; come acquisiscono tale proteina 
dal fluido interstiziale o dal plasma, subito si arricchiscono in 
colesterolo libero rilasciato dalle cellule dei tessuti periferici e dai 
macrofagi. L’intervento dell’enzima lecitin colesterolo acil-
transferasi permette l’esterificazione del colesterolo libero e il suo 
immagazzinamento nel “core” delle HDL mature che, in tal modo, 
si ingrandiscono 
(1, 12)
. 
f) Le HDL sono i principali vettori del trasporto inverso del 
colesterolo (cioè dalla periferia al fegato) che può avvenire 
essenzialmente in due modi: o le particelle HDL-contenenti-ApoE 
vengono captate dagli epatociti attraverso la via mediata dal 
recettore LDL, oppure la proteina trasportatrice del colesterolo 
esterificato, in circolo, permette lo scambio di colesterolo e 
trigliceridi rispettivamente tra le HDL e le lipoproteine ricche in 
trigliceridi, che poi vengono internalizzate dal fegato 
(1, 2, 12)
. 
Mi preme di sottolineare soprattutto questo: il ruolo dell’apolipoproteina 
E nel metabolismo lipidico umano a livello sistemico non è semplicemente 
quello del ligando per uno specifico recettore. Quando i chilomicroni 
acquisiscono ApoE in circolo, non acquisiscono solo la capacità di legarsi 
al recettore epatico per i remnant o a quello per le LDL, ma anche una 
diversa conformazione strutturale che li rende più avidi di colesterolo 
libero o esterificato e più adatti alla captazione epatica. Questo vale anche 
per le VLDL, che già nascono con l’ApoE, ma è addirittura provato in vitro 
per le HDL 
(1)
. Le HDL nascenti, ricche in fosfolipidi e ApoA-I, ma prive 
di ApoE, non potrebbero mai farsi carico di tutto il colesterolo libero 
(successivamente esterificato) proveniente dai tessuti periferici. E non tutte 
 12
le HDL-conteneti-ApoE vengono captate dal fegato, a dimostrazione che la 
funzione di ligando non è obbligatoria per l’apoproteina E. 
Per quanto riguarda gli altri protagonisti del metabolismo lipidico, le 
LDL sono responsabili del trasporto di circa i 2/3 del colesterolo 
plasmatico totale (non dei lipidi totali, naturalmente) 
(12)
. Come le altre 
classi lipoproteiche, anche le LDL sono suddivisibili in sottoclassi di cui la 
più cospicua è costituita da particelle sferiche con un “core”  di colesterolo 
esterificato e un “guscio” di fosfolipidi , colesterolo libero e ApoB-100. 
L’ApoB-100 ha funzioni strutturali nella costituzione della lipoproteina 
LDL ed è soprattutto il ligando per i recettori LDL degli epatociti e dei 
tessuti periferici 
(2, 5, 12)
. 
Il fegato e molti altri tessuti (ma anche singoli tipi cellulari come i 
macrofagi) esprimono i recettori  per le LDL con una densità che dipende 
dal metabolismo cellulare del colesterolo 
(5)
: un’elevata captazione di 
lipoproteine ricche in colesterolo (remnant VLDL, IDL e LDL) determina 
una down-regulation dei recettori di superficie LDL e, 
contemporaneamente, l’inibizione dell’enzima cellulare 3-idrossi-3-
metilglutaril CoA reduttasi, che ha una velocità limitante nella sintesi del 
colesterolo 
(5)
. Quasi paradossalmente è stata scoperta una linea cellulare, 
derivante dai macrofagi umani, in cui l’attività della HMG-CoA reduttasi 
viene addirittura stimolata dall’incorporazione dei residui dei chilomicroni, 
già da soli fortemente aterogeni 
(5)
. Al contrario una scarsa captazione delle 
lipoproteine sopracitate determina una up-regulation recettoriale e 
l’attivazione della sintesi endogena del colesterolo. Questo è un normale 
meccanismo fisiologico di regolazione del metabolismo lipidico intra-
cellulare. Quali possono essere le ripercussioni sul metabolismo lipidico a 
livello sistemico ? La risposta cambia a seconda se ci troviamo di fronte ad 
 13
un individuo fenotipicamente “ben funzionante” oppure un individuo 
portatore di un disordine metabolico genetico. In un individuo normale, 
un’introduzione eccessiva e prolungata di lipidi porta ovviamente ad una 
sorta di autodifesa da parte delle cellule di quasi tutti i tessuti, con la 
drastica riduzione della sintesi endogena di lipidi, la down-regulation dei 
recettori LDL epatici ed un maggior passaggio di colesterolo libero alle 
HDL 
(5)
. L’organo che si fa carico di regolare la concentrazione plasmatica 
di lipoproteine è il fegato, e lo può fare in diversi modi: diminuendo o 
bloccando la sintesi di trigliceridi e colesterolo (come fanno gli altri 
tessuti), utilizzando i trigliceridi come fonte diretta di ATP o sintetizzando i 
corpi chetonici (utilizzabili dal sistema nervoso) e, soprattutto, aumentando 
l’escrezione di colesterolo con la bile 
(13)
. Tuttavia anche gli epatociti si 
devono difendere da un eccessivo apporto (esogeno o endogeno) di 
trigliceridi e colesterolo, per cui si verifica il fenomeno della down-
regulation dei recettori LDL epatici. Sappiamo che i recettori LDL epatici 
non legano solo le omonime lipoproteine ma anche le IDL, le HDL e una 
percentuale variabile delle VLDL remnant, permettendone il catabolismo. 
Ecco allora un aumento della concentrazione plasmatica media di 
colesterolo e trigliceridi, soprattutto di colesterolo-LDL, cioè 
un’iperlipidemia secondaria alla dieta 
(5)
.  
 14
 
Gli studi epidemiologici sull’apolipoproteina E e la cardiopatia 
ischemica 
 
E’ importante distinguere la popolazione generale dalla popolazione 
normale (cioè fenotipicamente normale), nell’indagine sul ruolo che 
l’ApoE esercita nella predisposizione o nello sviluppo dell’ateroscleròsi ? 
La risposta è senza dubbio sì, ma la sua giustificazione non è così banale 
come si potrebbe pensare a prima vista. Nella popolazione generale sono 
compresi tutti gli individui, di entrambi i sessi, di una data fascia 
(generalmente molto ampia) di età, quindi anche persone sopravvissute 
all’infarto del miocardio, portatori di un disordine metabolico che non 
hanno mai avuto un infarto, individui “protetti” dall’ateroscleròsi (per 
predisposizione genetica o per lo stile di vita) e innumerevoli altre 
situazioni umane. E’ ovvio, quindi, che lo studio degli effetti fisiopatologici 
del fenotipo dell’ApoE condotto sulla popolazione generale, è 
inevitabilmente viziato dalla presenza di una frazione non trascurabile di 
individui per la quale tali effetti sono completamente mascherati da altri 
fattori genetici o ambientali. Invece è obbligatorio considerare un campione 
della popolazione generale, per studiare la distribuzione degli alleli e dei 
fenotipi dell’ApoE, come si fa per ogni altro gene. La popolazione sana 
non offre solo la possibilità di essere utilizzata come controllo (o paragone) 
nei test statistici. Offre anche i seguenti vantaggi: a) è formata da individui 
fenotipicamente normali in base a parametri in gran parte arbitrari ma 
comunemente accettati; b)  tali individui possono essere portatori di geni 
recessivi o codominanti per molte malattie genetiche, quindi sono una fonte 
preziosa di informazioni sulle relative modalità di trasmissione; c) 
 15
permettono uno studio non viziato del ruolo fisiologico e fisiopatologico 
dell’apoproteina E. Nella maggior parte degli studi epidemiologici è molto 
importante il confronto diretto tra la popolazione normale (oppure la 
popolazione generale) ed un campione omogeneo che rappresenta l’insieme 
degli individui affetti da un ben preciso disordine metabolico. Per esempio 
nel caso dell’iperlipidemia familiare di tipo III (o disbetalipoproteinemia), 
la scoperta che la maggior parte degli individui affetti è portatrice 
dell’allele epsilon-2 dell’ApoE in omozigosi 
(2, 3, 5)
, mentre nella 
popolazione generale la frequenza del genotipo epsilon-2 / epsilon-2 è 
bassa rispetto ad altri genotipi (1%) e la prevalenza della malattia è ancora 
più bassa (1:10000), ha portato all’ipotesi, già in parte verificata, che 
l’ApoE ha un ruolo causale necessario ma non sufficiente, nello sviluppo 
della disbetalipoproteinemia 
(2, 5)
. Infine esiste un settore dell’indagine 
epidemiologica sulle malattie cardiovascolari, che ha come  popolazione di 
riferimento l’insieme degli individui che presentano un quadro (attuale o 
pregresso) di cardiopatia ischemica, e come fine quello di stabilire la 
percentuale attribuibile al gene dell’ApoE sul rischio totale di sviluppare la 
malattia aterosclerotica.