4
acellulari, sono considerate non tossiche data la loro incapacità di penetrare
all'interno della cellula, a causa della mancanza della catena lectinica. Tuttavia esse
mostrano una significativa tossicità per il trofoblasto, per le cellule fagocitarie e per
le cellule infettate da virus, i quali ne facilitano la penetrazione nel citoplasma
(Roberts e Selitrennikoff, 1986).
Finora sono state isolate più di trenta RIP monocatenarie da un'elevata varietà di
piante, mentre si conoscono solo pochi esempi di RIP bicatenarie. In generale le RIP
sono presenti in varie parti della pianta (foglie, semi, radici, lattice) ed in quantità
notevoli (Stirpe et al., 1992). Spesso, in zone differenti della stessa pianta, è possibile
estrarre RIP simili, ma non identiche, che sono considerate isoproteine.
L'abbondanza e l'elevato polimorfismo di queste proteine nel regno vegetale è
indice di un ruolo importante di queste molecole nella vita e nell'evoluzione delle
piante, ruolo misterioso tuttora oggetto di intensa ricerca.
1.2 Meccanismo d'azione
L'effetto diretto delle RIP-1 e della catena A delle RIP-2 sulla cellula eucariotica
è un danno ribosomiale irreversibile a carico della subunità 60 S, che diviene
incapace di legare i fattori di elongazione, con conseguente arresto della sintesi
proteica (Montanaro et al., 1973; Sperti et al., 1973).
Le attuali conoscenze sull'azione delle RIP derivano da studi eseguiti sulla
ricina, la RIP-2 estratta dai semi di Ricinus communis, scoperta verso la fine del
secolo scorso (Stillmark, 1888). Ad oltre 15 anni dall'osservazione dell'azione
selettiva di tale proteina su bersagli eucariotici (Montanaro et al., 1973) e
dall'individuazione del bersaglio specifico nella subunità 60 S (Sperti et al., 1973),
Endo e collaboratori (1987) dimostrarono che il danno funzionale, provocato dalla
RIP, è una conseguenza della modificazione del 28 S rRNA, che, insieme al 5 S
rRNA, al 5.8 S rRNA e a proteine specifiche, costituisce la subunità 4maggiore dei
ribosomi 80 S. La possibilità che questa RIP bicatenaria fosse un'endonucleasi era
stata precedentemente esclusa da Mitchell, i cui esperimenti avevano chiaramente
dimostrato che la ricina non aumentava la mobilità elettroforetica di nessuna specie di
rRNA (Mitchell et al., 1976).
Gli studi condotti da Endo e Tsurugi (1987) dimostrarono che la ricina, agendo
sui ribosomi di fegato di ratto, determina la rimozione di una specifica adenina,
l'adenina 4324, a livello di una regione altamente conservata del 28 S rRNA, sede
dell'interazione del ribosoma con i fattori di elongazione. A concentrazioni di
inibitore mille volte superiori a quella attiva sui ribosomi integri, la depurinazione
specifica avviene anche sul 28 S rRNA isolato, a dimostrazione che la tossina agisce
direttamente sull'rRNA (Endo et al., 1987; Endo e Tsurugi, 1988).
Le RIP, in generale, sono inibitori specifici dell'elongazione della catena
polipeptidica nascente e principalmente della tappa catalizzata da una particolare
5
GTPasi chiamata translocasi o "elongation factor 2" (EF-2). Normalmente questo
fattore, complessato con GTP, si lega al ribosoma determinando la translocazione,
caratterizzata da una serie di eventi che avvengono in modo concertato, distinti in:
* rilascio del tRNA deacilato dal sito P del ribosoma
* translocazione del peptidil-tRNA dal sito A al sito P
* esposizione del codone successivo nel sito A, in modo da permettere l'attacco
dell'aminoacil-tRNA complementare successivo.
L'idrolisi del GTP a GDP è necessaria per il distacco dell'EF-2 dal ribosoma. La
ricina è in grado di impedire il legame GTP-dipendente dell'EF-2 al ribosoma
(Montanaro et al., 1975; Sperti et al., 1976; Brigotti et al., 1989); inoltre la translocasi
legata al ribosoma lo protegge dall'azione di questa RIP (Fernandez-Puentes et al.,
1976; Brigotti et al., 1989). Ne consegue che il sito bersaglio delle RIP è sovrapposto
o comunque molto vicino al sito di riconoscimento dell'EF-2. Non risulta invece
compromesso il legame dell'aminoacil-tRNA al ribosoma (Montanaro et al., 1973;
Sperti e Montanaro, 1979; Brigotti et al., 1989) catalizzato dall' "elongation factor 1"
(EF-1).
L'idrolisi EF-1-dipendente del GTP è tuttavia inibita, suggerendo che i due
fattori di elongazione abbiano siti di legame diversi sul ribosoma, ma utilizzino un
sito GTPasico comune, compromesso dalle RIP (Sperti et al., 1975). Il legame
peptidico, catalizzato dalla peptidil transferasi, è invece del tutto insensibile all'azione
delle RIP (Montanaro et al., 1973).
La catena A della ricina possiede un'attività RNA-N-glicosidasica: la
depurinazione dell'adenina 4324 (nel ratto) del 28 S rRNA è dovuta all'idrolisi del
legame N-glicosidico tra il C
1
del riboso e l'N
9
della base azotata. Questa attività
enzimatica si è poi rivelata comune anche alle altre RIP saggiate (Endo et al., 1987;
Endo e Tsurugi, 1987).
Le RIP appartengono quindi alla famiglia delle N-glicosidasi, la quale
comprende molecole che agiscono su differenti substrati: uridina (Magni et al., 1975),
NAD
+
(Kaplan et al., 1951), S-adenosil omocisteina (Duerre, 1962).
Nei batteri è noto un gruppo differente di N-glicosidasi in grado di idrolizzare il
legame base-zucchero nel DNA; questi enzimi, molto probabilmente, sono coinvolti
nei meccanismi di riparazione del DNA, essendo in grado di riconoscere
specificamente basi danneggiate o non convenzionali (Lindahl, 1976; Lindahl et al.,
1977).
Le RIP differiscono notevolmente dalle DNA-N-glicosidasi, perchè tagliano uno
specifico legame N-glicosidico su più di 4000 basi presenti nell' rRNA maggiore
degli eucarioti (Endo e Tsurugi, 1987).
L'adenina 4324 di ratto si trova all'apice di un loop di 17 nucleotidi, sorretto da
uno stelo di basi appaiate. Il "GAGA" loop, così viene chiamato, presenta una regione
di 14 nucleotidi che si ritrova nel 28 S rRNA di ratto e di Xenopus, nel 26 S rRNA di
lievito, nel 23 S rRNA di Escherichia coli (Endo, 1988) ed appare universalmente
conservato. Nonostante la ricina non agisca sui ribosomi batterici (Greco et al.,
6
1974), essa a concentrazioni elevate depurina il 23 S rRNA isolato di E. coli a livello
dell'adenina 2660 omologa all'adenina 4324 di ratto (Endo e Tsurugi, 1988).
Probabilmente le proteine ribosomiali eucariotiche svolgono un ruolo importante
durante l'azione delle RIP.
Recentemente è stato appurato che alcune RIP monocatenarie agiscono sui
ribosomi di E. coli (Habuka et al., 1990; Hartley et al., 1991); però il substrato
naturale delle RIP a concentrazioni catalitiche dell'ordine del nanomolare è
esclusivamente il diciassettimero del 28 S rRNA nel ribosoma eucariotico integro. Le
RIP appaiono in grado di sondare il 28 S rRNA, riconoscendo in modo specifico la
struttura secondaria altamente conservata in cui è organizzato il "GAGA" loop.
E' interessante notare che questa regione è bersaglio non solo delle RIP, ma
anche di un'altra proteina inibente le sintesi proteiche cellulari: l'α-sarcina, estratta
dalla muffa Aspergillus giganteus. Si tratta di una ribonucleasi in grado di idrolizzare
un singolo legame fosfodiestereo, quello tra la guanina 4325 e l'adenina 4326 nel 28
S rRNA di ratto; la sua azione determina l'interruzione della continuità della catena
ribonucleotidica generando il cosiddetto α-frammento (Endo e Wool, 1982).
Nonostante il taglio avvenga ad un solo nucleotide di distanza rispetto al sito
bersaglio delle RIP, ne consegue un differente effetto funzionale a livello del
ribosoma 80 S.
Non solo è impedito il legame dell'EF-2 al ribosoma (sebbene in misura minore
rispetto alle RIP), ma soprattutto è inibito il legame EF-1-dipendente dell'aminoacil-
tRNA al sito A; infatti il legame dell'aminoacil-tRNA, o del peptidil-tRNA, al
ribosoma protegge il 28 S rRNA dall'azione dell'α-sarcina (Endo e Wool, 1982).
Il "GAGA" loop, sensibile all'azione delle RIP, dell'α-sarcina ed accessibile ai
fattori di elongazione, risulta di vitale importanza per il corretto funzionamento del
ribosoma.
1.3 Aspetti applicativi
Per secoli in Cina l'aborto è stato realizzato utilizzando una pozione ricavata
dalle radici del Trichosanthes kirilowii, una cucurbitacea.
Il principio attivo responsabile dell'effetto abortivo è stato identificato nella
tricosantina, una RIP-1 che induce l'aborto nel topo, nel coniglio e nella scimmia
(Chang et al., 1979). Attualmente la tricosantina è impiegata nel trattamento del
corioncarcinoma. Anche tutte le altre RIP finora saggiate mostrano un simile effetto
abortivo (Barbieri et al., 1993); la causa è l'elevata tossicità di queste proteine per il
trofoblasto, dovuta probabilmente alla sua intensa attività pinocitosica.
Particolarmente promettente risulta, quindi, l'impiego delle RIP come agenti
abortivi in medicina veterinaria.
Un secondo uso delle RIP deriva dalla loro capacità di prevenire la replicazione
7
virale: infatti il patogeno ne facilita l'ingresso nel citoplasma delle cellule infette, con
il conseguente blocco delle sintesi proteiche (Roberts e Selitrennikoff, 1986).
A questo proposito l'esempio più significativo è offerto dal PAP (Pokeweed
Antiviral Protein), la RIP-1 estratta dalla Phytolacca americana, che fu scoperta ed
isolata proprio grazie alle sue proprietà antivirali. Affascinante risulta la scoperta che
alcune RIP sono in grado di inibire la replicazione del virus dell'HIV a dosi inferiori
rispetto a quelle che provocano il blocco delle sintesi proteiche cellulari (McGrath et
al., 1989; Lee-Huang et al., 1990, 1991). Nonostante sia ancora oscuro il meccanismo
che blocca la replicazione dell'HIV nelle cellule infette, è in atto uno studio clinico su
malati di AIDS a cui vengono somministrate preparazioni di tricosantina (Byers et
al., 1990; Kahn et al., 1990).
L'impiego delle RIP nella terapia dell'AIDS è uno dei traguardi più ambiti dalla
ricerca.
L'applicazione più promettente e più studiata prevede l'utilizzo delle RIP
coniugate ad anticorpi monoclonali: questo complesso prende il nome di
immunotossina.
In questo modo si possono colpire in modo mirato bersagli specifici indesiderati
come cellule tumorali o infettate da virus. Come carrier possono anche essere
impiegati ormoni, fattori di crescita, lectine, ma gli anticorpi monoclonali sono i
vettori per eccellenza.
Oltre ai successi in terapia antitumorale, particolarmente degno di nota è
l'impiego delle immunotossine nella terapia anti-HIV. Il PAP, coniugato ad anticorpi
monoclonali diretti contro antigeni propri delle cellule T CD4+ (il principale bersaglio
dell'HIV-1), provoca un'inibizione della replicazione virale a dosi mille volte inferiori
a quelle efficaci con il PAP non coniugato (Zarling et al., 1990) e a tali dosi i
coniugati non influiscono sulle funzioni delle cellule T CD4+ normali.
Per nulla trascurabili, infine, le conoscenze acquisite, grazie allo studio delle
RIP, circa le varie fasi della sintesi proteica, la struttura del ribosoma e la sua
topografia funzionale.
8
2. LA GELONINA
2.1 Presunta resistenza dei ribosomi di Artemia salina all'azione di
questa RIP
La gelonina, isolata dai semi di Gelonium multiflorum, è una RIP monocatenaria
di 30.5 kDa con attività RNA-N-glicosidasica sui ribosomi eucariotici (Endo et al.,
1988; Stirpe et al., 1988). Come la ricina, e molte altre RIP, è un potente inibitore
delle sintesi proteiche nel sistema di lisato di reticolociti di coniglio traducente
l'mRNA endogeno (Stirpe et al., 1980; Endo et al., 1988; Brigotti et al., 1989). La sua
IC
50
(concentrazione di inibitore che determina il 50% di inibizione delle sintesi
proteiche) in questo sistema è di 0.4 nM. L'interesse per questa proteina è sorto
dall'osservazione della sua inefficacia in un sistema di sintesi proteica semplificato,
costituito da ribosomi isolati di Artemia salina (un piccolo crostaceo d'acqua
salmastra), da acido poliuridilico [poli(U)] come messaggero, da [14C] fenilalanil-
tRNA come fonte dell'aminoacido e da una frazione proteica grezza contenente i
fattori di elongazione. Nemmeno una concentrazione di gelonina 400 volte superiore
(150 nM) alla sua IC
50
sul lisato di reticolociti di coniglio è in grado di bloccare, in
questo sistema, la sintesi poli(U)-dipendente della polifenilalanina (Brigotti et al.,
1989).
Nel sistema poli(U)-dipendente i ribosomi di A. salina sono invece sensibili alle
RIP estratte da numerose piante: Ricinus communis (Sperti et al., 1976), Adenia
digitata (Montanaro et al., 1978), Momordica charantia (Barbieri et al., 1980) e
Adenia volkensii (Brigotti et al., 1989); la resistenza alla gelonina risultava, quindi,
inaspettata e curiosa al tempo stesso.
2.2 Presenza nel supernatante post-ribosomiale di coniglio (S-140) di
cofattori
Sorprendente fu la scoperta che anche i ribosomi di reticolociti di coniglio, se
saggiati nel sistema poli(U)-dipendente di A. salina, sono insensibili alla gelonina.
Ciò dimostra, da un lato che i ribosomi di A. salina non sono intrinsecamente
resistenti alla gelonina, dall'altro che, molto probabilmente, il sistema di saggio usato
con questi ribosomi è privo di qualche componente necessario all'azione di questa
RIP.
Infatti, indipendentemente dalla fonte dei ribosomi (coniglio o A. salina)
e dalla natura del messaggero [mRNA endogeno o poli(U)], la sensibilità dei
ribosomi alla gelonina dipende da appropriati cofattori presenti nel sistema di
reticolociti di coniglio (Sperti et al., 1991).
Tali cofattori, identificati nell'ATP ed in un componente macromolecolare
9
presente nell'S-140 di coniglio, rendono i ribosomi estremamente suscettibili alla
gelonina (Sperti et al., 1991).
2.3 Dipendenza da cofattori di altre RIP
Questi risultati sono in accordo con osservazioni precedenti, fatte da altri autori,
con la tritina, la RIP-1 del Triticum aestivum, ed il PAP, la RIP-1 estratta dalla
Phytolacca americana. La sensibilità di sistemi di traduzione del poli(U) alla tritina è
fortemente incrementata quando i ribosomi (provenienti da cellule di ascite di
Ehrlich) sono preincubati con ATP e tRNA, ed il fenomeno è mediato da un fattore
legato al ribosoma diverso da EF-1 o EF-2 (Coleman e Roberts, 1981).
Similmente, ATP e supernatante post-ribosomiale sono richiesti durante la
preincubazione dei ribosomi di germe di grano o di A. salina con il PAP, al fine di
ottenere l'inibizione delle sintesi proteiche nel sistema poli(U)-dipendente (Ready et
al., 1983).
La dipendenza da cofattori, già nota per il PAP e la tritina, e individuata
successivamente per la gelonina, suggerì di indagare altre RIP monocatenarie. Oltre
la gelonina, il PAP e la tritina furono saggiate: la briodina, estratta dalle radici di
Bryonia dioica; la licnina, isolata dai semi di Lychnis chalcedonica; la
momorcochina-S, isolata dai semi di Momordica cochinchinensis; la momordina,
estratta dai semi di Momordica charantia; la saporina-6, isolata dai semi di
Saponaria officinalis ed infine la barley RIP, estratta dai semi di Hordeum vulgare.
Il confronto dei valori di IC
50
di ciascuna RIP saggiata in un sistema poli(U)-
dipendente, in assenza ed in presenza di ATP e S-140, conferma la dipendenza da
cofattori di gelonina, PAP e tritina.
Il risultato più eclatante, tuttavia, è quello ottenuto con la barley RIP, la quale
risulta 70000 volte più attiva in presenza piuttosto che in assenza di ATP e S-140
(Carnicelli et al., 1992).
La presenza di cofattori non modifica sostanzialmente il potere inibitorio di
momordina, briodina, licnina, momorcochina-S e saporina-6 (Carnicelli et al., 1992).
2.4 Indizi sul ruolo dell'RNA extraribosomiale
In un primo momento la richiesta di ATP e fattori extraribosomiali per
l'inattivazione di ribosomi isolati da parte della gelonina suggerì l'ipotesi suggestiva
del coinvolgimento di un'attività protein-chinasica.
L'osservazione che l'azione dei fattori extraribosomiali aveva come bersaglio i
ribosomi e non la RIP (Sperti et al., 1991) avvalorava l'ipotesi che la fosforilazione di
proteine ribosomiali ad opera di chinasi citoplasmatiche potesse rendere il ribosoma
sensibile alla gelonina (Sperti et al., 1991).
10
Si procedette, quindi, ad una parziale purificazione dell'attività stimolante
l'azione della gelonina (Gelonin-Promoting Activity = GPA) dell'S-140 mediante gel-
filtrazione su Superose 12 e successiva cromatografia a scambio anionico su Mono Q
(Brigotti et al., 1993). L'attività responsabile della sensibilizzazione dei ribosomi alla
gelonina fu risolta in due picchi. Entrambi i picchi, così come l'originale S-140,
mostravano un'attività chinasica sulle proteine ribosomiali (Brigotti et al., 1993).
La supposta correlazione tra GPA e fosforilazione delle proteine ribosomiali fu
tuttavia smentita utilizzando l'inibitore più potente e a largo spettro delle protein-
chinasi: la staurosporina (Tamaoki, 1991). Si dimostrò che la staurosporina, pur
impedendo la fosforilazione delle proteine ribosomiali, non interferiva sulla GPA
(vedere Materiali e Metodi) promossa dall'S-140 completo e dai due picchi isolati
(Brigotti et al., 1993). Un'ulteriore prova a sostegno dell'esclusione di un'attività
protein-chinasica fu la dimostrazione importantissima che la GPA non induce una
modificazione ribosomiale stabile (Brigotti et al., 1993), ma essa appare in grado di
cooperare con la gelonina, operando una modificazione transitoria del ribosoma tale
da permettere alla RIP di riconoscere il proprio sito bersaglio.
In accordo con questi risultati, esperimenti successivi hanno dimostrato che un
RNA, presente nel supernatante post-ribosomiale sia di coniglio che di fegato di ratto,
è il principale cofattore responsabile della sensibilizzazione alla gelonina di ribosomi
isolati (Brigotti et al., 1994). La prima osservazione fu che il trattamento con RNAasi
(nucleasi micrococcica o RNAasi A) del supernatante post-ribosomiale distruggeva
totalmente la GPA. Successivamente, mediante cromatografia a scambio anionico del
supernatante su Fast Flow Q Sepharose (FFQ), fu individuato un picco, eluito dalla
resina ad elevata forza ionica (vedere Materiali e Metodi), costituito prevalentemente
da RNA e dotato di GPA.
L'attività dell'RNA isolato era soltanto il 10% di quella del supernatante
originale, indicando che l'RNA è un cofattore indispensabile ma non l'unico coinvolto
nella GPA. Il ruolo di una o più proteine presenti nel supernatante post-ribosomiale è
dimostrato dal fatto che l'attività di quest'ultimo è distrutta non solo dalle RNAasi, ma
anche dal trattamento con proteinasi K. In questa fase è probabile il coinvolgimento
dell'ATP, in quanto la GPA di entrambi i supernatanti, sia di coniglio (Sperti et al.,
1991) sia di ratto (Brigotti et al., 1994), è strettamente ATP-dipendente, mentre
l'effetto dell'RNA isolato è solo lievemente incrementato in presenza del nucleotide
trifosfato.
Analisi successive hanno permesso di caratterizzare ulteriormente l'RNA. I dati
dimostrano (Brigotti et al., 1994) che questo RNA, in elettroforesi su gel di
poliacrilamide in presenza di sodio dodecil solfato (SDS-PAGE), ha la stessa
mobilità elettroforetica dei tRNA; però i tRNA presenti nel picco attivo da FFQ sono
in gran parte deacilati ed in gran parte troncati, cioé privi di un CCA integro in 3'
(tripletta caratteristica dei tRNA e di fondamentale importanza per il legame
dell'aminoacido).
Come si vedrà nella sezione Risultati, il tRNA attivo come cofattore della
11
gelonina ha un'elevata somiglianza, in sequenza, con un tRNA assai conservato nei
mammiferi e negli uccelli: il tRNATrp.
12
MATERIALI E METODI
Materiali
[γ-
32P]ATP (>5000 Ci/mmole), [5'-32P]pCp (3000 Ci/mmole), idrolisato di [U-
14C] proteine di alghe (52 mCi/milliatomo Carbonio), [3H]triptofano (30 Ci/mmole) e
[
14C]fenilalanina (513 mCi/mmole) sono stati forniti da Amersham (The
Radiochemical Centre, Bucks., U.K.).
La gelonina (la RIP-1 di 30.5 kDa estratta dai semi di Gelonium multiflorum), la
polinucleotide chinasi, l'aminoacil-tRNA sintetasi di fegato bovino, il tRNA totale di
lievito e il tRNAPhe sono stati forniti da Sigma Chemical CO. (St. Louis MO, U.S.A.).
Il fenilalanil-tRNA è stato preparato a partire da tRNAPhe e [14C]fenilalanina
secondo il metodo di Hultin e Naslund (1978).
RNA ligasi T4 e RNAasi H (1100 unità/ml) sono state fornite da Pharmacia
Biotech (Uppsala, Sweden).
La momordina (la RIP-1 di 31 kDa estratta dai semi di Momordica charantia) è
stata donata dal Prof. Fiorenzo Stirpe del Dipartimento di Patologia Sperimentale.
Poli(U) e 5 S rRNA isolato da Escherichia coli MRE 600 sono stati forniti da
Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germania). Il 5 S rRNA è stato marcato
con [5'-
32P]pCp usando RNA ligasi T4 (England et al., 1980).
I marcatori di peso molecolare pGEM costituiti da frammenti di DNA (36-2645
coppie di basi), forniti da Promega Corporation (MA, U.S.A.), sono stati marcati
sostituendo l'estremità 5'-fosfato originale con fosforo radioattivo in presenza di [γ-
32P]ATP e di polinucleotide chinasi (Berkner e Folk, 1977); l'eccesso di ATP è stato
rimosso mediante gel-filtrazione su colonna di Biogel P4 (0.3 x 16 cm, equilibrata
con 200 mM ammonio acetato) ed i frammenti di DNA marcati eluiti dalla colonna
sono stati precipitati con etanolo.
La tRNA nucleotidiltrasferasi è stata purificata dal lisato di reticolociti di
coniglio secondo il metodo di Gross et al. (1992).
La maggior parte dei reagenti chimici utilizzati per il sequenziamento dell'RNA
appartengono al kit di sequenza del DNA di DuPont-NEN (procedura di Maxam-
Gilbert).
I due oligodeossinucleotidi sono stati sintetizzati con un sintetizzatore Applied
Biosystem model 391 PCR MATE presso il Lepetit Research Center di Gerenzano e
sono stati purificati mediante gel-filtrazione su colonna di Biogel P2 (Brigotti et al.,
1993): il primo, 5'-TGACCCCGACGTGATTCG-3', è complementare alle posizioni
55-72 del tRNATrp di fegato bovino (oligo 1); il secondo, 5'-CCGGGTTCGATTCCC-
3', riproduce una sequenza conservata dalla posizione 48 alla 62 del tRNAGlu di ratto e
del tRNAGly di ratto e di topo e non ha alcun rapporto di complementarietà con il
tRNATrp (oligo 2).
13
Soluzioni
Il tampone di omogenizzazione del fegato di ratto era 10 mM Tris -HCl pH 7.4,
contenente 0.25 M saccaroso, 5 mM MgCl
2
, 0.002% aprotinina, 0.1%
fenilmetilsulfonil fluoruro e 10 mM β-glicerofosfato.
Il tampone A conteneva 20 mM Tris -HCl pH 7.0, 2 mM EDTA, 0.5 mM EGTA,
2 mM ditiotreitolo, 10 mM β-glicerofosfato, 1 mM benzamidina e 0.1% Triton X-
100.
Il tampone B era come il tampone A, però senza Triton X-100.
Supernatante post-ribosomiale di fegato di ratto
E' stato ottenuto da un omogenato di fegato di ratto 1:10, mediante successive
centrifugazioni a 1100, 20000 e 105000 g.
Fonte dell'RNA cofattore
L'RNA è stato ottenuto dal supernatante post-ribosomiale di fegato di ratto
mediante cromatografia a scambio anionico su Fast Flow Q Sepharose (FFQ).
Il supernatante (200 ml; 7 mg di proteina per ml) è stato caricato (flusso 5
ml/min) su una colonna FFQ (2 x 22 cm) equilibrata con il tampone A. La colonna è
stata lavata con 200 ml di tampone A e poi con 150 ml di tampone B. L'eluizione è
stata eseguita con un gradiente da 0 a 1 M di NaCl (400 ml) in tampone B.
Sono state raccolte frazioni da 10 ml e , dopo averle dializzate contro il tampone
A, 2 µl di ciascuna sono stati saggiati per l'attività stimolante l'azione della gelonina
(Gelonin-Promoting Activity = GPA, vedere avanti). L'attività era presente in un
picco, eluito dalla resina ad elevata forza ionica (0.7 M NaCl), contenente
prevalentemente RNA. Sulle frazioni del picco riunite, sono state eseguite due
successive estrazioni con egual volume di fenolo per eliminare le proteine e l'RNA è
stato precipitato dalla fase acquosa con 2.5 volumi di etanolo.
Saggio dell'attività stimolante l'azione della gelonina (GPA)
L'attività sensibilizzante i ribosomi all'azione della gelonina è stata misurata con
un saggio eseguito in due tappe: nella prima, 10 pmoli di ribosomi di Artemia salina
(preparati come descritto da Sierra et al., 1974) sono stati preincubati in presenza ed
in assenza di cofattori con 5 nM gelonina (una concentrazione di RIP di per sè
inattiva in assenza di cofattori, Sperti et al., 1991) in 10 µl di 10 mM Tris -HCl pH 7.4
14
contenente 100 mM ammonio acetato, 2 mM magnesio acetato e 1 mM ATP.
Dopo 10 minuti di incubazione a 28°C, nella seconda tappa, sono stati prelevate
2.5 pmoli di ribosomi (1pmole/µl) da ciascun campione e la loro inattivazione,
indotta dalla gelonina nella prima tappa, è stata quantificata in un sistema di sintesi
proteica traducente il poli(U).
Sistema di sintesi proteica traducente il poli(U)
Il sistema conteneva, in 100 µl, 80 mM Tris -HCl pH 7.4, 120 mM KCl, 7 mM
magnesio acetato, 2 mM ditiotreitolo, 2 mM GTP, 22 pmoli di [14C]fenilalanil-
tRNA, 80 µg di poli(U), 2.5 pmoli di ribosomi e 80 µg (come proteina) di S-105
(supernatante post-ribosomiale di Artemia salina precipitato al 75% di saturazione di
solfato d'ammonio, Sierra et al., 1974).
Dopo 10 minuti a 28°C, la reazione è stata bloccata in ghiaccio con 1 ml di 0.1
N KOH e le proteine sono state precipitate con 1 ml di acido tricloroacetico (TCA) al
20%; poi i campioni sono stati filtrati attraverso filtri di microfibre di vetro
(Whatman GF/C) effettuando 6 lavaggi (ognuno da 5 ml) con TCA al 5%. Dopo aver
aggiunto 10 ml di liquido di scintillazione Ready Gel (Beckman Instruments,
Fullerton, CA, U.S.A.), la radioattività è stata misurata con un contatore di
scintillazione.
Purificazione dell'RNA da FFQ mediante gel elettroforesi sequenziale
L'RNA da FFQ è stato frazionato su un gel (lunghezza 40 cm) di poliacrilamide
al 10% contenente 4 M urea. Il gel è stato sezionato in corrispondenza delle bande,
frantumato e l'RNA è stato estratto mediante incubazione per 12 ore a 25°C in un
tampone (2 ml per ciascuna banda) contenente 0.1% SDS, 10 mM magnesio acetato e
0.5 M ammonio acetato. Prima di procedere al saggio della GPA, l'RNA è stato
precipitato con 2.5 volumi di etanolo e separato dalle impurità del gel [che avrebbero
potuto interferire con il saggio di traduzione del poli(U)] mediante cromatografia su
una colonna Mono Q (HR 5/5). L'RNA, eluito dalla colonna a 0.8 M NaCl (Brigotti
et al., 1994), è stato recuperato mediante precipitazione etanolica.
La frazione più attiva ottenuta dal gel precedente è stata sottoposta ad una
seconda elettroforesi su un gel (lunghezza 20 cm) di poliacrilamide al 20%
contenente 7 M urea. Le bande sono state eluite e l'RNA è stato saggiato per l'attività
stimolante l'azione della gelonina come sopra.
L'RNA attivo eluito dal secondo gel è stato marcato con [5'-32P]pCp e sottoposto,
per controllarne la purezza e stabilirne il peso molecolare, ad una terza elettroforesi
su un gel (lunghezza 40 cm) di poliacrilamide al 20% contenente 8 M urea.
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Legame ai ribosomi dell'RNA cofattore
L'RNA attivo (eluito dal gel di poliacrilamide al 10%) è stato marcato in 3' con
[5'-
32P]pCp, fatto correre su un gel di poliacrilamide al 20% contenente 7 M urea per
rimuovere il [5'-32P]pCp non legato, eluito e portato ad una radioattività specifica di
10000 c.p.m./pmole con lo stesso RNA non marcato.
Il saggio di legame è stato eseguito nelle stesse condizioni della prima tappa del
saggio della GPA: 10 µl di 10 mM Tris -HCl pH 7.4, 100 mM ammonio acetato e 3.5
mM magnesio acetato contenevano 10 pmoli di ribosomi di Artemia salina e da 1 a
10 pmoli di RNA (in 6 µl di tampone A).
Dopo 10 minuti a 28°C, i campioni sono stati diluiti con 5 ml di tampone (20
mM Tris -HCl pH 7.4, 20 mM KCl, 10 mM magnesio acetato) e l'RNA legato ai
ribosomi è stato raccolto su filtri Millipore. I filtri sono stati lavati tre volte con 5 ml
dello stesso tampone e saggiati per la radioattività.
Sequenza dell'RNA cofattore
L'RNA attivo eluito dal secondo gel è stato marcato in 3' con [5'-32P]pCp
(England et al., 1980) oppure in 5' con [γ-32P]ATP (Chaconas e van de Sande, 1980). I
due campioni sono stati separati dal nucleotide radioattivo in eccesso mediante
elettroforesi per 6 h a 2000 V su un gel (spessore 0.75 mm) di poliacrilamide al 20%
contenente 8 M urea.
L'RNA è stato eluito dal gel e frazioni contenenti 100000 c.p.m. sono state
sottoposte alle reazioni di modificazione chimica previste dal metodo di
sequenziamento chimico dell'RNA (Peattie, 1979).
Il metodo si basa su modificazioni specifiche delle basi dei quattro nucleosidi
(adenosina, guanosina, citidina e uridina), modificazioni che consentono, in una
seconda reazione, la scissione della catena polinucleotidica. Per tutte le basi, le
condizioni di reazione sono tali da non indurre più di una modificazione per molecola
di RNA trattata, generando così, per ogni molecola, un solo frammento radioattivo la
cui lunghezza dipende dal sito in cui è avvenuta la modificazione chimica. Essendo
tale sito casuale, il risultato finale sarà una serie di frammenti la cui lunghezza indica
la posizione della base modificata. Tali frammenti daranno la scaletta di bande
caratteristica del gel di sequenza.
Le reazioni di modificazione utilizzate sono:
* G (Peattie e Gilbert, 1980)
Nella reazione per la guanosina, il campione è stato trattato con dimetilsolfato
(DMS) che metila la posizione N
7
dell'anello purinico. La metilazione è stata seguita
da un trattamento con sodio boroidruro (NaBH
4
) che riduce il doppio legame 7,8 della
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base alchilata, indebolendo in tal modo il legame N-glicosidico con il riboso.
* C
La reazione per la citidina è stata eseguita in due modi: in C
1
(Peattie e Gilbert,
1980), il campione è stato trattato (come nel caso della guanosina) con DMS, che
alchila la posizione N
3
dell'anello pirimidinico. Un successivo trattamento con una
soluzione acquosa di idrazina al 50% causa la rimozione della base modificata
(idrazinolisi); in C
2
(Peattie, 1979), la tappa con DMS è stata omessa e l'idrazinolisi è
stata ottenuta trattando il campione con 3 M NaCl in idrazina anidra.
* U (Peattie, 1979)
Nella reazione per l'uridina, il campione è stato trattato come in C
1
, ma
l'idrazinolisi non è stata preceduta da trattamento con DMS.
* A (Peattie, 1979)
Nella reazione per l'adenosina, il campione è stato trattato con
dietilpirocarbonato (DEPC). La carbossietilazione della posizione N
7
apre l'anello
imidazolico della base azotata, indebolendo in tal modo il legame N-glicosidico con il
riboso.
Tutte queste reazioni rendono la catena polinucleotidica suscettibile alla
scissione con anilina (pH 4.5) a livello della base modificata. I frammenti nucleotidici
generati dalle cinque reazioni sono stati separati mediante elettroforesi eseguita a
2400 V su un gel (lunghezza 40 cm, spessore 0.4 mm) di poliacrilamide al 20%
contenente 8.3 M urea.
"Gel mobility shift" e digestione con RNAasi H
L'ibridazione dell'RNA, marcato in 3', con gli oligodeossinucleotidi è stata
valutata in un saggio di "gel mobility shift" (Li e Brow, 1993).
Questa tecnica permette di apprezzare l'avvenuta formazione dell'ibrido in modo
indiretto: infatti, il legame di un oligonucleotide complementare (oligo 1) all'RNA, ne
diminuisce notevolmente la mobilità elettroforetica, rispetto ad un controllo parallelo
contenente il solo RNA. Invece, in presenza di un oligo non complementare (oligo 2),
l'RNA non viene ritardato, a dimostrazione della mancata formazione dell'ibrido.
Nel saggio, il trattamento con RNAasi H è stato eseguito aggiungendo l'enzima
(0.22 unità/µl) al termine della reazione di ibridazione ed incubando il tutto a 37°C
per 20 minuti. I campioni sono stati fatti correre su un gel nondenaturante (Li e Brow,
1993) accanto a campioni non trattati con l'enzima.
Il trattamento con RNAasi H, in assenza ed in presenza degli
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oligodeossinucleotidi, è stato anche effettuato sull'RNA da FFQ non frazionato su gel
elettroforesi ed i campioni sono stati saggiati per l'attività stimolante l'azione della
gelonina.
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