Identificazione di mutazioni in pazienti italiani affetti da Amaurosi Congenita di Leber mediante analisi di microarray

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PREMESSA 
Da sempre l’uomo ha considerato la vista come il senso a lui più caro, e soltanto 
l’idea di una vita priva di luce e colori potrebbe rendere fragile e precaria 
l’esistenza di chiunque di noi. 
Le malattie genetiche a carico dell’occhio sono numerose e rappresentano una 
percentuale molto alta del numero totale di tutti i disordini ereditari umani ed è 
stato stimato che almeno la metà dei casi di cecità che colpisce i bambini 
nell’infanzia abbia una o più componenti genetiche. 
Negli ultimi anni si sono moltiplicati i progetti di ricerca mirati 
all’identificazione e alla caratterizzazione di nuovi geni-malattia nella speranza di 
fornire, una volta identificato il difetto responsabile, le basi molecolari per 
approntare un’adeguata terapia. Per quanto riguarda le malattie ereditarie a carico 
della retina, nonostante i notevoli passi in avanti compiuti nella comprensione dei 
meccanismi molecolari alla base di numerose patologie, molti ancora restano i 
geni coinvolti responsabili da identificare. 
 
1.1L’OCCHIO 
L’occhio è l’organo fondamentale dell’apparato visivo, ed è deputato alla 
percezione degli stimoli luminosi e ad una ricostruzione primordiale dell’orrizonte 
di esplorazione. Questo complesso organo di senso presenta, almeno nella 
maggior parte dei vertebrati (uomo compreso), una forma sferoidale, ed è situato 
all’interno dello spazio orbitario, circondato dalle pareti ossee della scatola 
cranica. Esso è delimitato da tre tuniche: fibrosa, vascolare e nervosa. (Figura 1)
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Figura 1. Struttura dell’occhio 
 
 - La tunica fibrosa è la più esterna delle tre ed è costituita posteriormente e 
lateralmente dalla sclera, anteriormente dalla cornea. La prima mostra un aspetto 
biancastro ed è essenzialmente costituita da vasi sanguigni, provenienti dalla 
tunica sottostante, e da fibre di collagene irregolarmente stratificate a formare uno 
spesso strato coriaceo, tale da garantire un’adeguata protezione alle delicate 
strutture contenute al suo interno. La seconda, invece, è il primo mezzo diottrico 
che la luce attraversa prima di raggiungere il fondo dell’occhio, ed è costituita da 
una lamina di tessuto connettivale che delimita il segmento anteriore del bulbo 
oculare, nel tratto in cui manca la sclera. In sezione trasversale è formata da una 
fitta ma regolare stratificazione di fibrille elementari di collagene che, unitamente 
all’assenza di vasi sanguigni, determinano la perfetta trasparenza del tessuto.
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- La tunica vascolare, detta anche uvea, consiste della coroide, del corpo ciliare e 
dell’iride. Situata al di sotto della sclera, la coroide è una membrana costituita da 
un plesso di vasi sanguigni immersi in una lamina connettivale ricca di cellule 
pigmentate. Tale organizzazione contribuisce a rendere questa membrana nerastra 
ed opaca in modo tale da prevenire la riflessione della luce. Anteriormente, in 
stretta continuità con la coroide, il corpo ciliato, costituito da numerosi processi 
ciliari, connette il cristallino alla tunica tramite una serie di fibre collagene (zone 
fibulari), costituendo il legamento sospensore del cristallino. Quest’ultimo regola, 
insieme ad una serie di fibre muscolari lisce,  la contrazione (accomodazione) del 
cristallino, lente biconvessa  racchiusa in una capsula fibrosa trasparente. 
Anteriormente al cristallino e posteriormente alla cornea, risiede l’iride, un 
diaframma discoidale disposto perpendicolarmente all’asse ottico con al centro il 
forame pupillare. Essa è istologicamente costituita da fibrocellule muscolari lisce, 
la cui contrazione determina il calibro della pupilla, e da numerosi vasi sanguigni 
e nervi, immersi in una matrice connettivale contenente una quantità variabile di 
cellule pigmentate (da cui il colore degli occhi).  
- La tunica nervosa è la più interna del globo oculare ed è costituita dalla retina, il 
vero polo ottico dell’occhio in grado di trasformare uno stimolo luminoso in 
segnale elettrico. 
La retina è un tessuto di origine nervosa che durante l'embriogenesi origina dalla 
vescicola ottica come estroflessione della regione pro-encefalica del tubo neurale. 
La sua funzione è quella di trasmettere le informazioni fotoelettriche al cervello, 
mediante il nervo ottico. Si presenta come un tessuto estremamente sottile, 
perfettamente trasparente ed incolore, fatta eccezione per il suo strato più esterno,
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costituito da cellule pigmentate di colore nero, che prende il nome di epitelio 
pigmentato retinico (EPR). La retina è ricca di cellule sensoriali fotorecettrici, 
altamente differenziate e specializzate, rappresentate dai "coni" e dai 
"bastoncelli", la cui sensibilità si può approssimare al limite ultimo stabilito dalla 
natura quantica della luce. Il loro campo d'azione è estremamente vasto, dalla luce 
più intensa tollerabile a quella più fioca percettibile (Alberts et al. 1991). 
La retina è composta da nove strati sovrapposti che, andando dalla superficie 
esterna (strato pigmentato) fino alla superficie interna (corpo vitreo) sono (figura 
2): coni e bastoncelli, membrana limitante esterna, granuli esterni, plessiforme 
esterno, granuli interni, plessiforme interno, delle cellule multipolari, delle fibre 
nervose e membrana limitante interna. 
 
Figura 2. Organizzazione della retina in sezione al microscopio ottico
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Strato dei coni e dei bastoncelli- I coni ed i bastoncelli, sono cellule altamente 
specializzate che prendono il nome dalla forma del loro segmento esterno e 
rappresentano gli elementi recettoriali del sistema visivo deputati alla trasduzione 
dell'energia luminosa in potenziali elettrici. I bastoncelli sono disposti in una fila 
semplice, a palizzata, perpendicolarmente alla membrana limitante esterna, sulla 
quale sembrano impiantati ed in corrispondenza della quale ha luogo la loro 
continuazione con la rispettiva fibra; la loro estremità libera è volta verso l'epitelio 
pigmentato, arrivando a contatto con le cellule che lo compongono; i coni 
terminano un po' prima. Nella maggior parte della retina i bastoncelli sono 
organizzati in gruppi, rigorosamente paralleli ed accostati gli uni agli altri, e ad 
ogni intervallo fra questi, si trova un cono. Complessivamente, i bastoncelli sono 
in numero di 75 milioni, i coni di 3 milioni. Nella fovea centrale, fino a 0,25 mm 
dal suo centro, non esistono che coni; al di là cominciano ad intercalarsi i 
bastoncelli, il cui numero aumenta progressivamente, fino a che, a 3-4 mm dal 
centro della fovea, sono divenuti venti volte più numerosi dei coni.  
Membrana limitante esterna- E' una linea sottile, netta e molto regolare che 
separa i segmenti esterni dei recettori da quelli interni. Le cellule di Muller 
terminano nella sua faccia profonda, concorrendo alla sua stessa  formazione. 
Strato dei granuli esterni- E' spesso circa 30-40 µm ed è costituito dai corpi 
cellulari dei recettori con i loro nuclei (detti “granuli”, da cui deriva il nome dello 
strato) e le loro espansioni. I prolungamenti lamellari delle cellule di Muller 
separano fra loro i corpi cellulari delle cellule visive. 
Strato plessiforme esterno-  E' un esile strato formato da un intreccio di sottili 
fibre decorrenti in vario senso. Al suo interno si trovano i rigonfiamenti terminali
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delle cellule recettoriali e quelli delle cellule bipolari. E' attraversato dalle cellule 
di Muller e vi si può trovare il corpo di qualche cellula orizzontale. 
Strato dei granuli interni-  E' spesso e caratterizzato dalla presenza di un gran 
numero di nuclei (granuli interni), che appartengono alle cellule orizzontali 
(disposte in doppia fila), alle cellule bipolari, più numerose, alle cellule di Muller 
ed alle cellule amacrine. 
Strato plessiforme interno- E’ uno strato spesso, ed è costituito da fibre 
intrecciate in tutti i sensi. Contiene le terminazioni delle cellule bipolari, delle 
cellule gangliari, delle cellule amacrine e di quelle orizzontali. 
Strato delle cellule gangliari-  Contiene, disposte in fila semplice e vicine l'una 
all'altra, le cellule gangliari (o multipolari) con la grossa origine dei loro 
prolungamenti. Al suo interno vi sono anche il corpo e le espansioni di parte degli 
astrociti ed i soliti prolungamenti delle cellule di Muller. 
Strato delle fibre nervose- Inizia sottilissimo al limite anteriore della parte 
ottica della retina e, per aggiunta delle fibre nervose originate dalle cellule 
gangliari, diviene gradualmente più spesso nella direzione della pupilla, dove 
arriva al suo massimo di 20 µm. La direzione delle fibre si complica, dal lato 
temporale, per la presenza della macula, che le costringe a compiere archi 
concentrici intorno ad essa. I fasci che provengono dalle parti più periferiche della 
retina si portano alla parte centrale della pupilla, quelli dalle porzioni più vicine 
entrano nella sua parte periferica. 
Membrana limitante interna- E' formata dalla superficie basale delle cellule di 
Muller, riunite tra loro in uno strato continuo, con l'interposizione di una sostanza 
glicoproteica d’origine connettivale. Le cellule radiali di Muller si estendono in
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altezza come sottili pilastri che si dispongono radialmente a riempire tutto il 
volume non occupato dalle cellule nervose. Esse formano inoltre, con estensioni 
specializzate dei loro prolungamenti, le membrane limitanti della retina. Questi 
elementi, detti di sostegno, sono stati a lungo considerati elementi passivi. In 
realtà, sono sede di numerosi fenomeni elettrici concomitanti con l'attività dei 
neuroni retinici. 
 
 
1.2-FOTORECETTORI ED IL MECCANISMO 
MOLECOLARE DELLA VISIONE 
La visione si realizza mediante un complicato processo di fototrasduzione che ha 
luogo nella retina, sede dei fotorecettori e  tessuto di origine nervosa, deputata alla 
trasformazione dei segnali visivi in segnali elettrici.  
I fotorecettori sono vere e proprie cellule nervose altamente specializzate, ricche 
di proteine e pigmenti visivi sensibili a radiazioni elettromagnetiche di diverse 
lunghezze d’onda. I bastoncelli sono recettori della luce monocromatica mentre i 
coni recettori dei colori; i primi sono più numerosi nella regione periferica della 
retina; mentre i secondi in quella centrale, ovvero nella fovea.  
Entrambi i tipi cellulari si presentano istologicamente con forma più o meno 
allungata, caratteristica per ciascun tipo, e constano di un segmento esterno 
contenente un sistema di membrane ripiegate ed impilate, ovvero l'apparato 
fotorecettore, di un segmento interno contenente molti mitocondri (visto l’elevato 
metabolismo e consumo energetico), di una struttura microtubulare che funge da
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connessione tra i due, ed infine di una regione che instaura contatti sinaptici con le 
cellule nervose della retina (Figura 3).  
I due tipi di cellule sensoriali rispondono a differenti segnali luminosi perché 
sono dotati di complessi fotosensibili diversi: i bastoncelli contengono, in grandi 
quantità, la rodopsina, una proteina altamente sensibile alla luce; i coni 
contengono tre pigmenti fotosensibili, detti opsine, ciascuno con una risposta 
spettrale diversa, rispettivamente alle frequenze del rosso, del verde e del blu. 
Sebbene i due tipi di cellule fotorecettoriali presentino una notevole differenza 
nella soglia di stimolazione della luce (alta nei coni e bassa nei bastoncelli), 
entrambi agiscono in base a meccanismi molecolari molto simili. Sia nei coni che 
nei bastoncelli, infatti, i pigmenti visivi assorbono l'energia elettromagnetica di un 
fotone, convertendo il segnale luminoso in uno stimolo elettrico, che, partendo 
dalla retina e viaggiando attraverso il nervo ottico, raggiunge il Sistema Nervoso 
Centrale.
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Figura 3. Cellule fotorecettrici 
 
Le membrane dei dischi esterni della cellula fotorecettrice, in condizioni di 
scarsa o nulla luminosità, sono fortemente depolarizzate. Tale corrente 
depolarizzante, detta “corrente di buio”, è dovuta all'apertura dei canali per il Na
+
, 
presenti nella membrana plasmatica del segmento esterno, e determina l’apertura 
dei VOCCs  (Voltage Operated Calcium Channels), ossia di canali per il Ca
2+
 
voltaggio dipendenti, presenti soprattutto nella regione sinaptica. L’apertura 
determina un rapido e massiccio afflusso di ioni Ca
2+
 e, di conseguenza, un 
costante rilascio a livello sinaptico del neurotrasmettitore eccitatorio Ca
2+
-
dipendente glutammato. In presenza di luce, invece, si verifica una rapida 
chiusura dei canali per Na
+
, indotta da una complessa cascata di reazioni, sicché il 
potenziale di membrana diminuisce e la membrana si iperpolarizza. Ciò determina
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una riduzione della proteina G
Ca2+
 e la chiusura dei canali del Ca
2+
 presinaptici 
con conseguente riduzione della secrezione di neurotrasmettitore (Figura 4). 
L’interazione con la luce e la catena di eventi che provocano la chiusura dei 
canali per il Na
+
, hanno luogo esclusivamente nel segmento esterno del 
bastoncello. Questa regione contiene una serie di membrane discoidali impilate, 
sede della trasduzione dei segnali luminosi.  
 
Figura 4. Depolarizzazione di un fotorecettore  
 
Ogni disco è costituito da una membrana chiusa, attraversata più volte dalla 
rodopsina (figura 5), un pigmento visivo tipico dei bastoncelli, costituito da una 
glicoproteina omologa ai recettori accoppiati a proteine G con sette regioni trans 
membrana,  chiamata opsina e da una molecola di cromoforo, l'11-cis-retinale, 
derivato della vitamina A, legata covalentemente all'opsina.