Identificazione dell'enzima Nicotinamide N-metiltrasferasi quale marker molecolare del carcinoma renale a cellule chiare. Clonaggio, espressione e purificazione della proteina ricombinante.

nell’ambito delle patologie neoplastiche a carattere urologico (2). Per quanto 
concerne l’incidenza sesso-correlata, i soggetti maschi presentano un rischio 
doppio, rispetto a quelli di sesso femminile, di sviluppare la patologia (4), 
mentre l’incidenza età-correlata presenta un picco massimo intorno alla 
sesta-settima decade di età (3). Il carcinoma renale sembra essere più 
frequente nei paesi settentrionali dell’Europa e dell’America, mentre si 
riscontra con minor frequenza nei paesi orientali sia asiatici, sia africani (5). 
All’atto della sua diagnosi la neoplasia risulta localizzata nel 70-80% della 
casistica clinica, mentre nel 20-30% dei pazienti sono già presenti metastasi. 
Tuttavia nel 30% dei pazienti trattati chirurgicamente sulla base di evidenze 
cliniche di patologia neoplastica localizzata, si sviluppano metastasi (6). 
L’aspettativa di vita nei pazienti con carcinoma renale metastatico è di 6-12 
mesi, con una sopravvivenza a 5 anni non superiore al 10% (7). 
 
1.1.2 Classificazione istopatologica e caratteristiche 
citogenetiche 
Il carcinoma renale è una neoplasia di natura epiteliale, poiché si origina 
dalla trasformazione delle cellule che costituiscono l’epitelio del tubulo 
contorto prossimale (8). Tra i vari istotipi è possibile distinguere: 
1. il carcinoma renale convenzionale o a cellule chiare (75-80%) che 
rappresenta la neoplasia renale di maggiore incidenza nell’adulto, 
2. il carcinoma renale papillare o a cellule cromofile (10-15%), 
3. il carcinoma renale a cellule cromofobe (4-6%), 
 2
4. il carcinoma dei dotti collettori o dei dotti di Bellini, che trae origine 
dall’epitelio del tubulo distale (<1%), 
5. altre forme tumorali non classificabili (<2%) (9). 
La variante a cellule chiare è caratterizzata microscopicamente da cellule 
che si organizzano in architetture distese, alveolari o acinose. Tali strutture 
risultano circondate ed unite tra loro da uno stroma sensibilmente 
vascolarizzato. Le cellule “chiare”, costituenti la massa neoplastica, 
assumono una forma rotondeggiante o poligonale, presentano un nucleo di 
ridotte dimensioni ed un citoplasma abbondante e ricco di colesterolo, 
fosfolipidi e glicogeno (1). Le alterazioni genetiche ascrivibili all’istotipo 
convenzionale si riscontrano a carico del braccio corto del cromosoma 3 e 
comprendono traslocazioni e delezioni nelle regioni 3p12-14, 3p21, 3p25-26 
(10, 11). 
Il carcinoma renale di tipo papillare, altresì denominato tubulopapillare o 
papillifero, è caratterizzato dalla presenza di cellule che si organizzano in 
strutture tubulari o papillari. Tali cellule sono costiuite da un citoplasma 
suscettibile alla colorazione basofila o eosinofila (da cui il nome di carcinoma 
a cellule cromofile) e sono circondate da uno stroma di sovente soggetto ad 
infiltrazione da parte di macrofagi schiumosi (1). I profili citogenetici associati 
a tale patologia prevedono trisomie o tetrasomie degli autosomi 7 e 17 e la 
perdita del cromosoma Y (10, 11). 
L’istotipo cromofobo è costituito da cellule provviste di un citoplasma chiaro o 
moderatamente eosinofilo, con aspetto reticolato. A livello citosolico è 
apprezzabile la presenza di microvescicole del diametro di 150-300 nm che 
risultano positive alla colorazione con ferro colloidale. Le anomalie 
 3
cromosomiche riscontrate a livello dei nuclei delle cellule cromofobe 
contemplano la perdita di eterozigosi per i cromosomi 1, 2, 6, 10, 13, 17 e 21 
(1,11). 
 
1.1.3 Eziopatologia: cause genetiche e fattori di rischio 
Specifiche alterazioni cromosomiche vengono ascritte fra le cause 
d’insorgenza di forme di carcinoma renale convenzionale e papillare. La 
variante familiare del carcinoma renale a cellule chiare è stata riscontrata in 
associazione con la sindrome di von Hippel-Lindau. Tale patologia 
neoplastica familiare provoca la comparsa di tumori multipli in sedi diverse 
tra cui si distinguono masse renali maligne e benigne, sia bilaterali sia 
multifocali. Il 50% dei soggetti affetti dalla sindrome di VHL sviluppa il 
carcinoma renale che, in virtù della spiccata tendenza all’invasione e alla 
metastatizzazione, rappresenta la principale causa di decesso (12). 
La sindrome di von Hippel-Lindau insorge a causa dell’inattivazione 
funzionale della proteina pVHL, il prodotto del gene oncosoppressore VHL 
che segrega nella regione cromosomica 3p25-26 (13). La condizione 
genotipica necessaria per determinare il fenotipo neoplastico è la perdita di 
funzione da parte di entrambi gli alleli del gene VHL. Tale fenomeno è 
scatenato dall’azione congiunta di eventi differenti: 
1. l’inattivazione, mediante mutazione o ipermetilazione, di un allele del 
gene VHL a carico delle linee germinali dei pazienti, con conseguente 
ereditabilità del danno genetico, 
 4
2. la perdita dell’allele funzionante a causa della delezione del gene o di 
un’intera porzione cromosomica in seguito a traslocazione non 
bilanciata. 
L’inattivazione di entrambi gli alleli del gene VHL si presenta quindi come 
carattere distintivo sia delle forme ereditarie (o familiari), sia della maggior 
parte delle forme sporadiche di carcinoma renale a cellule chiare. In tali 
varianti l’acquisizione dei tratti genotipici non è congenita, pertanto 
l’insorgenza della patologia è tardiva rispetto a quanto accade nella sindrome 
di VHL e la massa neoplastica risulta unifocale (14, 15). 
La proteina pVHL funzionante forma, in associazione all’elongina C, 
all’elongina B, a Cul2, a Nedd8 e a Rbx1, un complesso multiproteico 
denominato E3 ubiquitina ligasi (o VEC), in grado a sua volta di legare la 
forma idrossilata della subunità α del fattore di trascrizione HIF. In condizioni 
normossiche la formazione di tale complesso conduce alla degradazione di 
HIF, mentre in caso di ipossia la forma stabilizzata (non idrossilata) di HIF, 
non essendo suscettibile al legame con VEC, è in grado di indurre la 
trascrizione di geni che portano alla produzione di proteine quali VEGF (che 
promuove l’angiogenesi), PDGF-B, GLUT-1, e l’eritropoietina. Tali 
meccanismi, innescati in maniera controllata e responsiva a una situazione di 
stress ipossico, possono tuttavia scatenarsi senza alcun tipo di regolazione 
in caso di inattivazione del gene VHL, condizione che conduce alla mancata 
produzione di pVHL e alla conseguente overproduzione delle proteine che 
caratterizzano la risposta fisiologica della cellula all’ambiente ipossico (12, 
16). 
 5
Forme familiari di carcinoma renale sono state identificate anche per la 
variante papillare a causa dell’attivazione, in questo caso, del protooncogene 
MET che segrega nella regione cromosomica 7q31.1-34. Il gene MET 
codifica per il recettore del fattore di crescita epatocitario HGF, molecola che 
regola i meccanismi di proliferazione e differenziamento epiteliale ed 
endoteliale di molti organi, compreso il rene. Il carcinoma renale papillare di 
tipo ereditario sembra essere causato da mutazioni nella porzione di MET 
che codifica per il dominio tirosin-chinasico di HGF (17). Le mutazioni a 
carico della linea germinale determinano la trasmissione del carattere 
genotipico secondo una modalità autosomica dominante e al contempo 
espongono l’individuo che ne è portatore al rischio congenito di sviluppare la 
neoplasia, come del resto accade per la sindrome di VHL. A livello somatico 
l’amplificazione dell’allele mutato, in seguito a trisomia del cromosoma 7 che 
caratterizza l’istotipo papillare, determina una duplicazione del proto-
oncogene mutato con conseguente aumento della produzione del recettore 
attivo (18). 
Nell’uomo non è stato a tutt’oggi identificato alcun agente eziologico 
selettivamente responsabile dell’insorgenza del carcinoma renale. Tuttavia 
gli studi epidemiologici hanno suggerito che il tabacco possa avere un ruolo 
importante nelle genesi di tale patologia. Tra i fattori di rischio sussistono 
inoltre l’obesità, l’ipertensione, una dieta ricca in grassi e proteine e povera di 
frutta e verdure, la scarsa attività fisica e le occupazioni professionali che 
espongono l’individuo al contatto con sostanze potenzialmente 
carcinogeniche (19). 
 
 6
1.1.4 Sintomatologia e diagnosi clinica 
La neoplasia renale presenta uno sviluppo per lo più silente per gran parte 
della sua durata; per tale ragione la sua diagnosi viene effettuata 
tardivamente rispetto alla storia della patologia. La classica triade 
sintomatologica, costituita da dolore, ematuria e presenza di una 
neoformazione al fianco, è riscontrabile solo in una ridotta percentuale di 
pazienti ed è espressione di un processo neoplastico in fase avanzata, 
caratterizzato dalla presenza di invasione locale o di metastasi a distanza 
(1). 
La diagnosi clinica del carcinoma renale viene principalmente effettuata 
mediante esami radiologici ai quali, successivamente, vengono affiancati 
esami di laboratorio. Le indagini strumentali più comunemente impiegate per 
l’identificazione e la caratterizzazione delle masse renali sono: 
• l’ecografia,  
• la TAC (tomografia assiale computerizzata),  
• la risonanza magnetica nucleare (RMN), 
• l’arteriografia, 
• l’urografia, 
• la pielografia, 
• e la scintigrafia. 
L’esame ecografico consente di evidenziare la presenza di masse renali e 
distingere le lesioni solide dalle più comuni cisti benigne. L’assenza di echi 
interni, la presenza di una parete liscia e ben definita e la buona 
ecotrasmissibilità sono indici di benignità. Tutte le lesioni che allo scandaglio 
 7
ecografico non soddisfino tali caratteristiche devo essere sottoposte ad un 
esame più accurato. Le masse renali solide infatti possiedono una 
ecogenicità variabile rispetto al parenchima renale sano, una ridotta o 
assente trasmissione e delle pareti scarsamente demarcate con contorni 
irregolari. 
Lo sviluppo della TAC ha completamente rivoluzionato l’iter diagnostico delle 
neoplasie renali tanto che, allo stato attuale, rappresenta la metodica di 
elezione per individuare e stadiare il carcinoma renale. Con l’impiego della 
TAC infatti la componente cistica o solida di una lesione renale complessa 
può accuratamente essere definita evitando il ricorso, dopo l’indagine 
ecografia, all’agobiopsia chirurgica. Oltre a distinguere adeguatamente le 
lesioni cistiche da quelle solide, la TAC con mezzo di contrasto permette di 
evidenziare l’estensione del tumore oltre la capsula renale o ai tessuti 
circostanti. È inoltre possibile determinare con grande accuratezza il 
coinvolgimento neoplastico della vena renale o della vena cava, evitando 
l’esecuzione della tradizionale cavografia. 
La risonanza magnetica pur essendo meno sensibile della TAC 
nell’identificazione di lesioni solide di piccole dimensioni, rappresenta un 
importante strumento d’indagine radiografica per la valutazione dell’entità 
dell’invasione neoplastica delle strutture adiacenti (vena renale o vena cava) 
senza l’impiego di alcun mezzo di contrasto. L’immagine multidimensionale 
che scaturisce da un esame mediante risonanza magnetica consente di 
ottenere un quadro dell’estensione del tumore allo scopo di pianificare le 
strategie d’intervento chirurgico. 
 8
L’arteriografia costituisce il principale esame diagnostico per avere 
informazioni riguardo alla vascolarizzazione renale. Il profilo arteriografico 
delle neoplasie renali contempla la presenza di una sensibile 
neovascolarizzazione, di fistole arterovenose, di ristagno del mezzo di 
contrasto e di ipervascolarizzazione della capsula. Tuttavia varianti 
ipovascolarizzate di tumore renale possono costituire un problema dal punto 
di vista diagnostico. A tale difficoltà è possibile ovviare mediante l’aggiunta al 
mezzo di contrasto di sostanze ad azione vasocostringente (adrenalina), in 
grado di determinare la vasocostrizione delle normali strutture vascolari e 
non di quelle tumorali (1, 20). 
 
1.1.5 Stadiazione 
I sistemi più comunemente adottati per la stadiazione del carcinoma renale si 
basano sulla classificazione di Robson (21) e sulla classificazione TNM (22). 
Il sistema di classificazione di Robson prevede 4 stadi: 
• Stadio I → Neoplasia confinata all’interno della capsula renale. 
• Stadio II → Neoplasia che si estende oltre la capsula renale, 
invadendo il tessuto adiposo perirenale, rimanendo confinata 
all’interno della fascia del Gerota. 
• Stadio III → Interessamento della vena cava inferiore o della vena 
renale (IIIa) o metastasi ai linfonodi regionali (IIIb) o la combinazione 
dei 2 casi (IIIc). 
• Stadio IV → Invasione degli organi limitrofi, tranne il surrene, (IVa) o 
metastasi a distanza (IVb). 
 9
 Tumore primitivo (T) 
 
TX → Tumore primitivo non definibile 
T0 → Tumore primitivo non evidenziabile 
T1 → Tumore con dimensione massima ≤ 7cm, confinato al rene  
          T1a → Tumore con dimensione massima ≤ 4cm 
          T1b → Tumore con dimensione massima > 4cm e ≤ 7cm 
T2 → Tumore con dimensione massima > 7cm, confinato al rene 
T3 → Tumore che si estende ai maggiori vasi venosi o al surrene o al tessuto perirenale, 
          senza superare la fascia di Gerota 
          T3a → Tumore che invade la ghiandola surrenale o il tessuto perirenale, ma non 
                      supera la fascia di Gerota 
          T3b → Tumore che invade mascroscopicamente la/e vena/e renale/i o la vena cava 
                      al di sotto del diaframma 
          T3c → Tumore che invade mascroscopicamente la vena cava al di sopra del 
                     diaframma 
T4 → Tumore che si estende oltre la fascia di Gerota 
 
 
Linfonodi regionali (N) 
 
NX → Linfonodi regionali non valutabili 
N0 → Linfonodi regionali liberi da metastasi 
N1 → Metastasi in un singolo linfonodo regionale 
N2 → Metastasi in più linfonodi regionali 
 
 
Metastasi a distanza (M) 
 
MX → Metastasi a distanza non accertabili 
M0 → Metastasi a distanza assenti 
M1 → Metastasi a distanza presenti 
 
 
Raggruppamento in stadi 
 
Stadio I → T1, M0, N0 
Stadio II → T2, N0, M0 
Stadio III → T1, N1, M0 
                    T2, N1, M0 
                    T3, N0 o N1, M0 
Stadio IV → T4, N0 o N1, M0 
                    ogni T, N2, M0 
                    ogni T, ogni N, M1 
 
 
 
 
Tabella 1. Rappresentazione schematica dei criteri di valutazione dei 
parametri clinico-patologici (T, N e M) e dell’attribuzione dello stadio 
patologico del carcinoma renale secondo la classificazione TNM. 
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