Glicosidi dell'Unità ripetitiva dello Streptococcus Pneumoniae 14 (SP14)

Introduzione 
 1 
1. Introduzione 
I carboidrati rappresentano una delle classi di composti organici naturali maggiormente 
diffusa in natura. Il concetto di carboidrati quali macromolecole bio-informative, come gli 
acidi nucleici e le proteine, è emerso solo recentemente nonostante essi abbiano 
rappresentato per molto tempo una delle più importanti classi di bio-molecole per la loro 
funzione metabolica e strutturale nei sistemi biologici (cellulosa, chitina, glicogeno. etc.). 
Dai numerosi studi di correlazione struttura-attività su catene oligosaccaridiche e 
glicoconiugati (come glicoproteine e glicolipidi) è emerso che le porzioni saccaridiche 
hanno un ruolo fondamentale in numerosi processi biologici.
1
 Gli oligosaccaridi, avendo a 
disposizione un ampio ventaglio di combinazioni possibili e diversi punti di ramificazione, 
possono generare strutture molto complesse in grado di regolare e modificare numerosi 
processi biologici. Essi sono spesso coinvolti nella comunicazione cellulare, hanno un 
ruolo chiave nella risposta immunitaria, nella duplicazione virale, nell’adesione cellula-
cellula, nonché nello sviluppo di numerose patologie, tra cui i processi infiammatori come 
l’osteoartrite e l’artrite reumatoide, le infezioni virali e batteriche ed i tumori, visto il loro 
ruolo nella trasmissione dei segnali responsabili della crescita cellulare incontrollata.  
Il coinvolgimento degli zuccheri nei processi biologici ha suggerito il loro uso in 
terapia con un conseguente sviluppo ed implementazione di molti farmaci a base di 
carboidrati.
2
 Anche se ad oggi esistono numerosi studi sulla comprensione della relazione 
struttura-attività di queste molecole, i risultati sono ancora molto lontani da quelli raggiunti 
con le proteine e gli acidi nucleici e questo spinge i ricercatori ad investigare sulla 
glicomica nella stessa sistematica maniera utilizzata per il DNA (genomica) e per le 
proteine (proteomica) con lo scopo di creare un catalogo, cellula per cellula, di strutture 
glicidiche e glicosiltransferasi coinvolte nella loro biosintesi.  
Una complicazione di questi studi risiede nel fatto che mentre il DNA e le proteine 
hanno essenzialmente sequenze lineari di quattro e venti possibili building blocks, gli 
zuccheri esibiscono spesso sequenze ramificate di 30 possibili building blocks tant’è che, 
ad esempio, il numero di isomeri lineari e ramificati di un esasaccaride è di 10
12
. Inoltre, 
per ottenere risultati certi sono necessarie abbondanti quantità di sequenze 
oligosaccaridiche in forma pura e strutturalmente definite.  
I saccaridi si trovano in natura in basse concentrazioni, spesso legati ad altre strutture 
complesse (proteine e lipidi), ed in forma micro-eterogenica, tant’è che il loro isolamento,
Introduzione 
 2 
quando possibile, è molto difficoltoso. D’altra parte il ruolo fondamentale dei 
glicoconiugati nei processi biologici ha portato ad una maggiore richiesta di nuovi ed 
efficienti metodi sintetici che permettessero la preparazione di un’ampia gamma di 
oligosaccaridi da poter utilizzare nell’indagine delle loro funzioni biologiche. L’accesso a 
tali composti dipende essenzialmente dalla sintesi chimica, anche se numerosi metodi di 
preparazione si basano su processi enzimatici che, pur essendo molto promettenti in quanto 
garantiscono la regio- e stereoselettività desiderata, soffrono del fatto che gli enzimi alla 
base di tali processi non sono accessibili. Poiché ogni legame glicosidico richiede uno 
specifico enzima, la sintesi enzimatica di un oligosaccaride richiede un discreto numero di 
enzimi e, ammesso che siano commercialmente disponibili, tale assemblaggio risulterebbe 
talmente costoso da rendere la sintesi non conveniente. Per tali ragioni la sintesi chimica di 
oligosaccaridi rimane la via più accessibile e rappresenta, attualmente, uno dei temi più 
importanti della chimica organica.  
 
1.1. – Lo Streptococcus Pneumoniae SP14 
 
Nonostante gli eccezionali progressi della medicina moderna vi sono ancora varie 
malattie in grado di causare un forte impatto sulla salute pubblica e uno dei maggiori 
problemi sanitari, anche nel mondo occidentale, continua ad essere quello delle infezioni 
causate da batteri patogeni, rese più temibili dalla farmaco-resistenza causata dell’intensivo 
uso di antibiotici. In questo contesto l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) pone 
particolare attenzione verso le strategie di prevenzione ed indica, nello sviluppo dei 
vaccini, una delle soluzioni più promettenti per ottenere una protezione efficace e duratura 
dell’organismo.  
L’esito di un processo infettivo è il risultato del rapporto tra la virulenza dell’agente 
infettante e l’efficienza della risposta immunitaria dell’ospite, che si esplica attraverso 
un’azione integrata del sistema immunitario innato (o aspecifico) e di quello adattivo (o 
specifico), responsabile dell’origine della memoria immunogenica. L’attivazione del 
sistema immunitario
3
 richiede un’azione integrata del braccio innato e di quello acquisito 
ed il collegamento tra questi due sistemi è effettuato dalle cellule presentanti l’antigene 
(APC) ovvero i macrofagi e le cellule dendritiche (CDs). In particolare, le CD immature 
rilevano e riconoscono gli eventuali antigeni estranei attraverso dei recettori di superficie e 
questo provoca, oltre all’emissione di citochine, anche un profondo mutamento della
Introduzione 
 3 
superficie cellulare, avviando il processo di maturazione delle DC. Le DC mature 
esprimono gli antigeni specifici del patogeno, perdono la capacità di endocitosi e migrano 
nei nodi linfatici ove amplificano la risposta immunitaria acquisita con la produzione di 
linfociti T antigene-specifici e inducendo la memoria immunogenica.  
I carboidrati, oltre ad essere coinvolti in numerosi processi biologici di vitale 
importanza, sono anche mediatori delle interazioni intracellulari responsabili della risposta 
immunogenica in quanto interagiscono con il sistema immunitario perché riconosciuti da 
diverse famiglie di proteine come la superfamiglia delle immunoglobuline e la 
superfamiglia delle lectine C-type degli animali.
3
 Questo ha indirizzato la ricerca 
dell’ultimo ventennio verso lo sviluppo di vaccini anti-batterici e anti-tumorali
4
 di natura 
saccaridica con l’obiettivo di prevenire l’infezione o limitare gli effetti patogeni inducendo 
una risposta attiva da parte del sistema immunitario di un individuo contro virus, batteri, 
tossine e neoplasie in modo da proteggerlo definitivamente (o comunque per un tempo 
molto lungo) da una successiva esposizione a tali agenti infettanti. 
Molti batteri patogeni posseggono capsule costituite prevalentemente da polisaccaridi 
e/o lipopolisaccaridi, e la difesa nei loro confronti è principalmente mediata dalla 
formazione di anticorpi specifici che si legano a questi polisaccaridi opsonizzando i batteri 
extracellulari ed avviandoli alla fagocitosi. In Europa e negli Stati Uniti, la stragrande 
maggioranza di infezioni batteriche è dovuta a ceppi di Streptococchi la cui patogenicità è 
attribuita alla capsula batterica di natura polisaccaridica. Le malattie pneumococciche sono 
la causa di 1.6 milioni/anno di decessi nel mondo, specialmente nei paesi in via di sviluppo 
ed oltre la metà di questi decessi è rappresentato da bambini al di sotto dei 5 anni di età. 
Alla luce di questi dati l’OMS inserisce nel gruppo “ very high priority” lo sviluppo di 
vaccini contro le malattie pneumococciche. 
Lo Streptococco Pneumoniae (SP) è un batterio Gram positivo circondato da una 
capsula polisaccaridica (Figura 1) che lo protegge da fagocitosi da parte del sistema 
immunitario dell’organismo ospite e dalla lisi osmotica. Esso è responsabile di un 
vastissimo gruppo di patologie che possono portare a complicazioni come: batteriemia, 
meningite, polmonite, otite media, sinusite e bronchite. La pericolosità del batterio risulta 
più manifesta in quei soggetti che non hanno ancora un sistema immunitario 
completamente sviluppato, come i bambini, o deficitario, come gli anziani o i soggetti 
immunodeficienti. Ad oggi, l’unica cura è la terapia antibiotica che ha causato negli anni
Introduzione 
 4 
farmaco-resistenza rendendola sempre più inutile e portando alla formazione di ceppi 
resistenti.  
 
Figura 1 
 
La classificazione delle unità glicidiche ripetitive che costituiscono i polisaccaridi 
capsulari dello Streptococcus Pneumoniae (SP) ha permesso di raggruppare il batterio in 
diversi serotipi, di cui una dozzina (1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 14, 19, 23) sono responsabili 
dell’80% delle infezioni e di questi solo sette sono responsabili delle infezioni nei pazienti 
di età inferiore a sei anni (4, 6, 9, 14, 18, 19, 23). Anche per gli streptococchi, i 
polisaccaridi costituenti la capsula batterica (CPS) sono responsabili della risposta 
immunitaria ed inducono la produzione di anticorpi che conferiscono una protezione 
antibatterica specifica, una volta che l’individuo viene a contatto essi.  
La vaccinazione antipneumococcica a base di CPS purificati induce una risposta 
immunitaria debole e scarsamente efficiente specialmente nei bambini con età inferiore ai 
due anni, nelle persone anziane ed in soggetti adulti affetti da particolari patologie che li 
espongono a maggior rischio.
4
 In particolare per questi polisaccaridi la risposta anticorpale 
è T-indipendente e non persistente nel tempo, perchè non stimola i corecettori CD4+ dei 
linfociti T responsabili della memoria immunologica. Il vaccino antipneumococcico 23-
valente (Pneumovax PPV23), basato su miscele di CPS ottenuti per lisi controllata delle 
capsule di 23 serotipi (1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12, 14, 15B, 17F, 18C, 
19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F) differenti di SP (responsabili del 90% dei casi di malattie 
pneumococciche nei paesi industrializzati), induce una buona risposta anticorpale nel 60%-
80% degli adulti in buona salute e nei bambini sopra i due anni di età, la sua efficacia 
diminuisce al 21% in pazienti immunosoppressi. Si ritiene che questi polisaccaridi, 
costituiti da epitopi antigenici (unità ripetitive), attivino la proliferazione e la 
differenziazione delle cellule B attraverso la stimolazione di specifici recettori superficiali 
(BCR) con conseguente produzione di immunoglobuline a bassa affinità (IgM) che 
avviano il processo opsofagocitico.
3
 Questa limitazione è superata con la coniugazione dei 
polisaccaridi capsulari nativi (CPS) o loro frammenti con una proteina immunogenica, che
Introduzione 
 5 
permette di ottenere una risposta anticorpale T-dipendente inducendo una risposta cellulo-
mediata anche nei soggetti a rischio come bambini ed anziani.
4
 Un esempio di vaccino 
coniugato è rappresentato dal vaccino anti-pneumococcico 7-valente (PVC/7) che contiene 
oligosaccaridi provenienti da sette serotipi di Streptococchi (4, 6B, 14, 18C, 19F e 23F), 
ognuno coniugato con un mutante detossificato della tossina difterica CRM
197
. Il 
polisaccaride coniugato è internalizzato mediante un processo di endocitosi recettore-
mediato, con attivazione delle cellule professionali specializzate (APC) come le cellule 
dendritiche (CD) e i macrofagi, seguito da processazione della proteina carrier. Gli epitopi 
oligopeptidici vengono presentati, attraverso il complesso maggiore di istocompatibilità 
MHC di classe II (MHC II), ai corecettori proteici CD4+ presenti sui linfociti T che, 
attivandosi, esprimono sulla loro superficie molecole costimolatrici B7 (CD80, CD86) e 
liberano specifiche citochine (interleuchine e fattori di necrosi tumorale) in grado di 
indurre la differenziazione delle cellule B per dare luogo ad un clone di cellule in grado di 
generare immunoglobuline ad alta affinità (IgE, IgA, ma soprattutto IgG), ovvero anticorpi 
specifici.
3
  
Recentemente, per la le malattie pneumococciche, sono stati immessi in commercio 
due vaccini polisaccaridici coniugati (PVC/10 e PVC/13 valente) che, oltre ai sette serotipi 
presenti nel PVC/7, contengono altri serotipi come SP1 e SP5, responsabili di svariate 
infezioni pneumococciche nei bambini al di sotto dei due anni di età soprattutto in paesi 
dell’Asia e dell’Africa.  
Il vaccino coniugato 7-valente (PVC/7), nonostante abbia portato ad una riduzione, 
negli USA, del 77% di infezioni nei bambini al di sotto dei 5 anni, ha un costo troppo 
elevato che ne limita l’utilizzo soprattutto nei paesi in via di sviluppo. Data l’incidenza 
della malattia pneumococcica a livello mondiale e i limiti dei vaccini oggi presenti, risulta 
quindi di primaria necessità lo sviluppo di nuovi vaccini sintetici, dotati di maggiore 
spettro d’azione e di un costo più contenuto. E’ da sottolineare che l’uso dei polisaccaridi 
capsulari (CPS) nativi come vaccini antibatterici è tuttavia limitato dall’eterogeneità e dalla 
variabilità strutturale presente nei differenti serotipi della stessa specie, dalla presenza di 
eventuali contaminanti biologici e chimici e, nel caso dei vaccini coniugati, anche da una 
possibile ipersensibilità indesiderata della proteina carrier.
4 
 
Un’alternativa importante all’uso dei CPS nativi è data dalla sintesi chimica di 
frammenti delle unità ripetitive, seguita dalla loro coniugazione con una proteina carrier
5
 
che permette la preparazione di vaccini con una struttura chimica ben definita e con
Introduzione 
 6 
completa assenza di contaminanti derivanti dalla matrice batterica. Un esempio di questo 
approccio è il vaccino coniugato sintetico
6
 contro l’Haemophilus Influenzae di tipo B 
(Hib). Considerando che gli oligosaccaridi, analogamente alle proteine e agli acidi nucleici, 
sono notevolmente suscettibili alla biodegradazione, che ne limita il loro uso terapeutico, 
un ulteriore vantaggio che offre la preparazione dei vaccini sintetici è la possibilità di 
ottenere analoghi strutturali dei frammenti dei CPS naturali più stabili ma con 
immunogenicità paragonabile.  
Il gruppo di ricerca del Dipartimento di Scienze Farmaceutiche sede Chimica 
Bioorganica e Biofarmacia, dove è stata svolta questa Tesi, insieme ad altri gruppi di 
ricerca, nell’ambito sia di progetti nazionali finanziati dal MIUR sia di collaborazioni 
scientifiche con la Novartsis Vaccines & Diagnostics di Siena, si sta occupando da tempo 
della sintesi chimica delle unità ripetitive costituenti i polisaccaridi capsulari dello 
Streptococcus Pneumoniae 19F (SP19F), dello Streptococcus Pneumoniae 19A (SP19A) e 
dello Streptococcus Pneumoniae 14 (SP14).  
Da un’analisi della letteratura si evince che per avere una risposta immunologica 
efficace e quindi un potenziale effetto di vaccinazione è necessaria la costruzione di 
molecole ad alto peso molecolare in grado di indurre una memoria immunogenica. Tale 
obiettivo può essere raggiunto attraverso almeno 4 strade:  
• sintesi completa dei polisaccaridi naturali in grado di indurre una risposta 
immunogenica. Ad esempio, per lo SP19F solo il dimero (esamero) o meglio il trimero 
(nonamero) dell’unità ripetitiva (trisaccaride) presentano una modesta attività 
immunologica;  
• coniugazione delle unità ripetitive o di piccoli oligomeri con una proteina in grado di 
provocare una risposta T-dipendente, allo scopo di migliorarne le proprietà 
immunogeniche.  
• oligomerizzazione delle unità ripetitive trisaccaridiche o di strutture monosaccaridiche 
attive con giunzioni interglicosidiche diverse da quelle naturali (fosfodiesteree) in 
modo da ottenere analoghi, ad alto peso molecolare, stabili in condizioni fisiologiche 
ed in grado di mimare gli oligomeri nativi; 
• sintesi di macromolecole, quali i glicodendrimeri o glycocluster (Figura 2), coniugati 
con un opportuno peptide immunogenico, in modo da ottenere sostanze ad alto peso 
molecolare che recano, sulla superficie di una struttura polifunzionale generata in
Introduzione 
 7 
maniera reiterativa intorno ad un “core” anch’esso polifunzionale, un elevato numero 
di unità glicidiche immunologicamente attive.  
 
Figura 2 
 
 
 
 
Lo Streptococcus pneumoniae 14 (SP14), i cui antigeni sono contenuti nel vaccino 
anti-pneumococcico 7-valente, rappresenta uno dei serotipi con maggiore incidenza nelle 
patologie pneumococciche. L’unità ripetitiva del polisaccaride costituente la capsula 
batterica è rappresentata da un tetrasaccaride di struttura {6)-[β-D-Galp-(1→4)]-β-D-
GlcpNAc(1→3)-[β-D-Galp-(1→4)]-β-D-Glcp-(1→}
n
. (1, Figura 3). 
 
Figura 3 
O
OH
OH
OH
O
O
O
OH
O H
O
OH
O
OH
OH
OH
O H
O
O
NHAc
O H
O
1
n
 
 
Questo ceppo batterico ha la peculiare caratteristica di avere un’elevata incidenza nelle 
malattie pneumococciche in tutti i continenti (USA 27%, Belgio 29%, Australia 22%, Sud 
Africa 19%, Ruanda 15%, Gambia 32%, Uruguay 40%).
7
 La scarsa immunogenicità 
dell’SP14 nativo, rispetto ad altri polisaccaridi di altri ceppi pneumococcici,
8a
 è attribuibile 
alla somiglianza strutturale dell’SP14 con saccaridi naturali presenti nell’organismo umano 
che esibiscono il frammento disaccaridico LacNAc [β-D-Galp-(1
4)-β-D-GlcpNAc], 
come gli antigeni saccaridici dei gruppi sanguigni umani, gli oligosaccaridi solubili del 
latte umano (HMO) e gli stessi determinanti antigenici del SP14. Dato che l’interazione del 
polisaccaride SP14 con i tessuti contenenti questi glicidi determina la comparsa di 
anticorpi autoreattivi, la coniugazione del polisaccaride SP14 nativo o di suoi frammenti 
con una proteina immunogenica elimina questo inconveniente ed induce una risposta 
immunogenica specifica ed efficace.  
Nel 1998 Jennings e coll.
8b
 hanno dimostrato che la coniugazione del polisaccaride 
nativo o di suoi frammenti, come ad esempio i derivati tetrasaccaridici 2a,b (Figura 4), con 
una proteina immunogenica [tossina difterica (CRM
197
) o albumina bovina (BSA)] 
determina una specifica risposta immunitaria inducendo opsofagocitosi nel topo.
Introduzione 
 8 
Figura 4 
O
OH
OH
OH
O H
O OR
O
NHAc
O H
O
OH
OH
OH
O H
O
O
OH
O H
O
OH
2a: R=(CH
2
)
3
S(CH
2
)
2
NH
2
2b: R= (CH
2
)
6
NH
2
2c: R=H
 
 
In uno studio recente (2008),
9
 volto ad identificare la più piccola struttura saccaridica 
in grado di indurre la produzione di anticorpi specifici per lo Streptococcus pneumoniae 
14, sono stati effettuati test biologici su topi usando frammenti saccaridici sintetici del 
polisaccaride SP14, costituiti da un numero variabile di monosaccaridi (3-12) coniugati 
con una proteina immunogenica (BSA o CRM
197
). Da questi risultati è emerso che il 
trisaccaride ramificato 3a [β-D-Galp-(1
4)-β-D-Glcp-(1
6)-β-D-GlcNAc] induce la 
produzione di specifici anticorpi contro lo SP14, mentre nel caso del tetrasaccaride 3b a 
struttura {β-D-Galp-(1→4)]-β-D-Glcp-(1→6)-[β-D-Galp-(1→4)]-β-D-GlcpNAc}, l’unità β-
galattopiranosidica legata alla posizione 4 della glucosammina migliora significativamente 
l’induzione della opsonofagocitosi nel topo ed inibisce la crescita di pneumococchi in 
vitro. 
 
Figura 5 
 
O H OR
O
NHAc
O H
O
OH
OH
OH
O H
O
O
OH
O H
O
OH
O
OH
OH
OH
O H
O OR
O
NHAc
O H
O
OH
OH
OH
O H
O
O
OH
O H
O
OH
3a
3b
spacer protein R=
 
 
Da questi studi è emerso, inoltre, che a differenza degli altri polisaccaridi capsulari 
(SP19F o SP19A) dove solo gli oligomeri delle unità ripetitive trisaccaridiche (esamero, 
nonamero, dodecamero, etc) avevano attività immunogenica, nel caso dei frammenti del 
CSP di SP14, la coniugazione di due o tre unità tetrasaccaridiche tipo 3b (dimero o 
trimero) non fornisce significative differenze dell’attività anticorpale, che risulta, infatti, 
paragonabile a quella ottenuta con 3b. Da ciò si deduce che il frammento tetrasaccaridico 
3b (Figura 5) è la struttura minima in grado di dare una risposta immunogenica specifica e
Introduzione 
 9 
può rappresentare il punto di partenza per lo sviluppo di un vaccino oligosaccaridico 
sintetico coniugato contro le infezioni causate da SP14. Ciò deve tenere conto, oltre 
all’identificazione di efficienti sintesi di questi oligosaccaridi, anche la ricerca della 
migliore presentazione dell’epitopo al sistema immunitario. 
 
 
1.2. – Generalità sulle reazioni di glicosidazione 
 
Lo stadio chiave della sintesi oligosaccaridica è la reazione di glicosidazione, che 
avviene, nella maggior parte dei casi, secondo un meccanismo di sostituzione nucleofila al 
carbonio anomerico (Schema 1). Altri approcci prevedono, ad esempio, reazioni di 
addizione a zuccheri 1,2-insaturi (glicali).  
 
Schema 1 
O
X
PO
O
O
OP
O
PO
O
X
PO
O
OR
PO
O
OP
O H
PO
PO
+
Promotore
+
ROH
Promotore
Glicosil donatore Glicosil accettore
 
Mentre la specie nucleofila prende il nome di glicosil accettore, l’agente glicosilante è 
comunemente chiamato glicosil donatore ed esibisce, nella posizione anomerica, un gruppo 
uscente che può essere attivato con un adeguato promotore (Schema 1). In base al tipo di 
gruppo uscente esistono numerosi metodi di glicosidazione,
10
 che vengono scelti in base 
alla strategia necessaria per ottenere il target saccaridico desiderato. Nonostante i notevoli 
progressi ed i numerosi studi effettuati sulle reazioni di glicosidazione, ad oggi non esiste 
un metodo che possa essere definito universalmente applicabile, in quanto questa tipologia 
di reazione è fortemente dipendente da molteplici fattori come la stabilità chimica, la 
reattività e la compatibilità del sistema di attivazione con i gruppi protettivi presenti sulla 
coppia accettore-donatore. Una reazione di glicosidazione chimica ideale dovrebbe avere 
le stesse caratteristiche di una glicosidazione enzimatica, ovvero essere quantitativa, 
veloce, sperimentalmente facile e soprattutto regio- e stereoselettiva. La stereoselettività è 
sicuramente il limite delle reazioni di glicosidazione, in quanto è quasi impossibile 
perseguire reazioni S
N
2 pulite sul carbonio anomerico. Ciò è attribuibile all’assistenza 
vicinale dell’ossigeno endociclico che stabilizza il carbocatione derivante dalla perdita del 
gruppo uscente sulla posizione anomerica, conferendo a tali reazioni un considerevole 
carattere S
N
1. In base all’orientazione spaziale del sostituente anomerico, il nuovo legame