Endocrine Disruptors: Fertilità maschile e Metalli pesanti

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particolare interesse lo studio dei danni citogenetici che può apportare 
a livello spermatico. E’ stata proposta un’ampia gamma di meccanismi 
molecolari che riflette le differenti proprietà chimiche dei vari metalli, 
tra cui la formazione, in vivo, di complessi che vanno incontro a 
ossidoriduzioni producendo ROS e/o ioni metallici ad alta valenza con 
proprietà ossidanti nei confronti degli acidi nucleici. Alcuni prodotti 
del danno ossidativo al DNA, incluso la 8-idrossi-desossiguanosina (8-
OH-dG) e le rotture al DNA, inducono lesioni premutazionali che 
possono portare a trasformazioni neoplastiche o a mutazioni stabili. 
Ad oggi però poco si sa sul meccanismo di induzione di tali danni 
ossidativi su spermatozoi umani.  
Lo scopo di questa tesi è la messa a punto di un protocollo per il 
trattamento in vitro di spermatozoi umani con metalli di interesse 
ambientale, in particolare con due composti inorganici del Cd e 
dell’As: cloruro di cadmio (CdCl
2
) e arsenito di sodio (NaAsO
2
), e la 
successiva misurazione del danno genetico indotto al DNA, sia in 
termini di danno primario, sia in termini di danno ossidativo. Per tali 
esperimenti sono stati preliminarmente esaminati alcuni parametri 
sperimentali quali le condizioni di coltura e il terreno di coltura da 
utilizzare per gli spermatozoi.  
Per ognuno dei cinque campioni spermatici sono stati effettuati 
quindi trattamenti in vitro di 60 minuti con solo terreno di coltura e con 
tre dosi di controllo positivo H
2
O
2
; inoltre per i primi tre sono stati 
effettuati trattamenti con quattro dosi di NaAsO
2
, mentre gli altri due 
campioni sono stati trattati con quattro dosi di CdCl
2
. 
 7 
In seguito al trattamento è stata valutata la motilità spermatica 
per ogni punto sperimentale di ogni donatore valutando la percentuale 
di spermatozoi con motilità rettilinea lenta e veloce. Inoltre su ogni 
campione, mediante l'applicazione del test della cometa (SCGE, single 
cell gel electrophoresis) nella versione modificata, è stata valutata 
l’induzione di danno primario e ossidativo al DNA spermatico dovuta 
al trattamento. 
Questo sistema sperimentale fa uso di enzimi in grado di 
riconoscere e tagliare specifiche lesioni nel DNA (endonucleasi III e 
formammidopirimidina glicosilasi) con attività glicosilasica e liasica, 
che convertono le basi ossidate in rotture a singolo filamento, 
permettendo quindi di evidenziare, oltre al danno primario indotto al 
DNA dalle due sostanze, anche l’ossidazione di pirimidine e purine, 
inclusa la formazione di 8-OH-dG, tipico marcatore di danno 
ossidativo. Le analisi dei preparati sono state effettuate mediante un 
sistema di acquisizione di immagini al microscopio a fluorescenza 
(Komet 5.5).  
Dai risultati ottenuti è emerso che il controllo positivo (H
2
O
2
) 
induce una forte diminuzione della motilità, in particolar modo alla 
dose 200 µM, in tutti i donatori e induce anche un significativo 
aumento di danno primario, misurato con il test della cometa, valutato 
tramite il test statistico non parametrico di Friedman. 
Per quanto riguarda il trattamento con i metalli si sono trovati 
incrementi di danno al DNA ed effetti sulla motilità che però non sono 
risultati statisticamente significativi.  
 8 
Tale risultato potrebbe derivare dal fatto di aver utilizzato un 
protocollo per il test della cometa in spermatozoi (McKelvey-Martin et 
al., 1997) probabilmente non sufficientemente sensibile da poter 
rilevare livelli di danno al DNA non molto elevati, oppure i composti 
metallici da noi utilizzati potrebbero esercitare un’azione genotossica 
(ad esempio formazione di legami crociati) in parte non evidenziabile 
tramite il test della cometa, che misura l’induzione di danno al DNA in 
termini di rotture a singola e doppia elica. 
 9 
INTRODUZIONE 
 
Alcune evidenze sperimentali ed epidemiologiche sembrano indicare 
che l’uomo e le altre specie animali hanno subito effetti negativi sulla 
salute come conseguenza dell’esposizione a sostanze chimiche che 
sono in grado di interferire con il normale funzionamento delle varie 
componenti del sistema endocrino. Nel corso di un convegno 
patrocinato dalla United States Environmental Protection Agency (US 
EPA), queste sostanze, per le quali è stato coniato il termine di 
"endocrine disruptors" (nel seguito, ED) o il termine "endocrine 
disrupting chemicals", sono state definite come agenti esogeni che 
interferiscono con la produzione, il rilascio, il trasporto, il 
metabolismo, il legame, l’azione o l’eliminazione di ormoni che, 
naturalmente presenti nell’organismo, sono responsabili del 
mantenimento dell’omeostasi e della regolazione dei processi di 
sviluppo. Anche la Commissione europea (DG XII) ha organizzato, in 
collaborazione con la European Environmental Agency e lo European 
Centre for Environment and Health della WHO, un Workshop 
internazionale sull'impatto degli ED sulla salute umana e sull'ambiente 
(Weybridge, UK, 24 dicembre 1996). Nel corso dei lavori di questo 
Workshop, sono stati discussi i rischi potenziali dovuti agli ED. In tale 
occasione sono state valutate le conoscenze attuali, identificati i 
problemi epidemiologici emergenti, valutate le possibili relazioni con 
l'esposizione a inquinanti ambientali e identificate le necessità future 
sia per quanto riguarda le attività di monitoraggio che quelle di 
ricerca. La conclusione del Workshop è stata che il problema degli ED 
 10 
è fonte di preoccupazione e richiede l'adozione di misure di 
regolamentazione, pur non suscitando al momento particolari allarmi. 
Tra gli inquinanti ambientali a distribuzione ubiquitaria per i quali 
sono stati riportati, soprattutto in specie animali selvatiche, effetti sul 
sistema endocrino e sull’apparato riproduttivo vanno considerati 
alcuni composti organoalogenati molto noti (dibenzodiossine e 
dibenzofurani clorurati, esaclorobenzene, bifenili policlorurati, bifenili 
polibromurati, pentaclorofenolo),un vasto elenco di pesticidi 
(soprattutto organoclorurati tra cui diclorodifeniletani, ad esempio il 
DDT, ciclodieni, esaclorocicloesani  e i più recenti fungicidi triazolici, 
inibitori della sintesi degli steroidi), gli alchilfenoli, il bisfenoloA, gli 
ftalati, i dimeri e i trimeri dello stirene, il benzo(a)pirene, e alcuni 
metalli pesanti (piombo, cadmio e mercurio). Anche per alcune 
sostanze naturali (incluse alcune micotossine), potenzialmente presenti 
in diverse componenti della dieta, sono stati dimostrati effetti 
estrogenosimili sia in vivo che in vitro. Per quanto riguarda l’uomo 
esistono alcune evidenze di effetti nocivi in individui che abbiano 
subito esposizioni relativamente elevate sia a composti organici, ad 
esempio l'estrogeno sintetico dietilstilbestrolo (DES), che inorganici (ad 
esempio il piombo). Inoltre è stata postulata una eziologia ambientale 
sia per le alterazioni dell’apparato riproduttivo (declino della qualità 
del seme umano, decremento della quantità degli spermatozoi) sia per 
l'aumento di anomalie congenite del tratto genitourinario (aumento 
dell’incidenza di malformazioni quali criptorchidismo e ipospadia) che 
per l’aumento di alcuni tumori quali quello del seno, della prostata e 
del testicolo che possono avere alla loro base fattori endocrini.  
 11 
Sebbene una relazione di causaeffetto non sia stata provata è 
comunque ben noto che le normali funzioni di tutti gli organi e i 
sistemi sono regolate da fattori endocrini; quindi alterazioni endocrine, 
specialmente in alcune fasi critiche, quali lo sviluppo embrionale e 
fetale, la gravidanza e l’allattamento, possono portare a effetti profondi 
e soprattutto permanenti. La valutazione dei rischi per la salute umana 
e l’ambiente derivanti dall’esposizione a ED deve tenere conto di due 
ordini di problemi. Il primo è la messa a punto di sistemi sperimentali 
in vitro e in vivo atti sia ad identificare con sufficiente sensibilità sia a 
caratterizzare con precisione gli effetti sull’equilibrio endocrino. Infatti 
i metodi di studio attualmente utilizzati possono non essere adeguati a 
valutare eventuali effetti sul sistema endocrino. Questo è 
particolarmente vero per esposizioni che hanno luogo, risultando 
particolarmente dannose, in periodi di maggiore suscettibilità, quali 
particolari momenti dello sviluppo dell’organismo, allorché il sistema 
endocrino ha un ruolo chiave nel regolare processi essenziali sia 
fisiologici che morfologici. Il secondo problema è quello di stabilire se 
nell’ambiente esistono livelli di ED tali da esercitare un'azione negativa 
sulla salute della popolazione generale, considerando la presenza di 
situazioni di maggiore suscettibilità (la gravidanza, lo sviluppo 
intrauterino e peripostnatale) e di gruppi particolarmente esposti (ad 
esempio per attività lavorative o abitudini alimentari). L’impatto 
sanitario e ambientale può essere considerevole se si tiene conto da un 
lato dei potenziali effetti sugli esseri viventi, osservati 
sperimentalmente anche per dosi relativamente basse (almeno per 
alcuni ED quali l’esaclorobenzene), e dall’altro dei molteplici usi 
 12 
agricoli e industriali e/o della presenza ubiquitaria e persistente 
nell’ambiente delle sostanze chimiche attualmente individuate come 
ED, il cui numero del resto è probabilmente destinato ad aumentare. 
La vastità del problema richiede la collaborazione tra esperti in varie 
discipline quali la tossicologia clinica, la medicina di laboratorio, la 
tossicologia sperimentale, l’ecotossicologia, la microanalisi chimica e 
l'epidemiologia nelle sue varie branche clinica, ambientale e 
molecolare. E’ necessaria inoltre una razionalizzazione degli sforzi al 
fine di colmare quelle lacune nelle attuali conoscenze che hanno 
un'importanza critica e di fornire un valido supporto scientifico per 
l’emanazione di regolamenti sui livelli di esposizione alle sostanze 
considerate, per la definizione delle priorità e per prendere decisioni 
nel campo della salute pubblica e della qualità dell’ambiente. In 
particolare, occorre acquisire solide conoscenze scientifiche riguardo:  
 
a) i livelli di inquinamento ambientale (da valutare attraverso adeguati 
programmi di monitoraggio);  
b) l’entità dell’esposizione della popolazione generale e di gruppi a 
rischio (ad esempio sul luogo di lavoro) attraverso un adeguato 
programma di monitoraggio biologico; 
c) la relazione tra la dose interna e la prevalenza o l’insorgenza di 
condizioni patologiche attraverso l'effettuazione di adeguati studi 
epidemiologici;  
d) l’insorgenza di eventi/alterazioni patologiche in modelli 
sperimentali animali e/o cellulari. 
 
 13 
Data quindi la necessità di un approccio multidisciplinare e 
considerata la limitata disponibilità di risorse finanziarie, appare 
necessario un coordinamento degli sforzi sia a livello nazionale che 
comunitario e internazionale. 
Negli Stati Uniti il National Science and Technology Council ha 
stabilito di sviluppare una strategia di ricerca su base nazionale per il 
triennio 1995/1998 nel campo degli ED. Una simile strategia è stata 
adottata anche dall’US EPA 4 . Anche la European Science Foundation 
ha indicato la valutazione dei rischi sanitari e ambientali derivanti 
dagli ED tra le priorità di ricerca per il triennio 1997/1999. Una 
trattazione del problema degli ED in tutti i suoi aspetti richiederebbe 
spazi molto ampi. Pertanto ci limiteremo in questa sede a fornire una 
breve descrizione di una ipotesi scientifica che riguarda la correlazione 
tra l’incremento delle alterazioni/nomalie dell’apparato genitale 
maschile e l’aumento dei livelli di ED ad azione estrogenosimile 
nell’ambiente.  
 
Aumento delle anomalie dell’apparato riproduttivo maschile:gli ED 
ad azione estrogenosimile come possibile causa  
 
Negli ultimi decenni si è assistito, in alcuni paesi, ad un aumento 
dell’incidenza di tumori testicolari (tumori delle cellule germinali, 
seminomi) e ad un probabile aumento dell’incidenza di alcune 
anomalie del tratto genitale maschile, quali il criptorchidismo e 
l’ipospadia. Parallelamente, secondo alcuni autori, si sarebbe verificato 
un declino nella qualità dello sperma e un decremento nel numero 
 14 
medio degli spermatozoi per eiaculato. I motivi alla base dell’aumento 
dell’incidenza di queste anomalie sono al momento sconosciuti. E’ 
stata avanzata l’ipotesi che questi cambiamenti possano essere stati 
causati da un aumento del livello di ED ad azione estrogenosimile 
nell’ambiente. Il seminoma si sviluppa a partire da uno stadio non 
invasivo di carcinoma in situ, le cui cellule hanno le caratteristiche di 
gonociti primordiali, con caratteristiche di malignità. In Danimarca, 
un’area ad elevato rischio per i tumori testicolari, vi è stato, dal 1940 al 
1980, un aumento di quattro volte nell’incidenza del cancro del 
testicolo. Aumenti paragonabili sono stati osservati in altri paesi, come 
gli Stati Uniti e la Scozia. Anche in zone storicamente a bassa 
incidenza, quali la Finlandia, vi è stato un aumento nelle ultime 
decadi. Il criptorchidismo e l’ipospadia sono anomalie del tratto 
genitourinario che si determinano durante lo sviluppo fetale. Un 
raddoppio dell’incidenza di criptorchidismo si è manifestato in 
Inghilterra e Scozia nel periodo dal 1950 al 1970. Simili aumenti sono 
stati documentati in altri studi. Anche per l'ipospadia è stato riportato 
un incremento da parte di un gruppo di studio internazionale. 
Riguardo la qualità dello sperma umano, una revisione sistematica 
della letteratura sull’argomento, relativa a 61 pubblicazioni con un 
numero totale di soggetti osservati pari a 14.947 unità, ha messo in 
evidenza una caduta altamente significativa degli spermatozoi 
nell'eiaculato da una media di 113 milioni/ml nel 1940 a 66 milioni/ml 
nel 1990. Inoltre, il numero di soggetti con oligozoospermia 
(concentrazione di spermatozoi < 20 milioni/ml) o con concentrazione 
di spermatozoi nella parte bassa dell’intervallo di normalità (20/40 
 15 
milioni/ml) è aumentato, mentre è diminuita la percentuale di soggetti 
con un elevato numero di spermatozoi per millilitro (> 100 
milioni/ml). Tuttavia queste modificazioni non sono state messe in 
evidenza od osservate in alcune delle meta analisi e degli studi più 
recenti; inoltre, sembrano esservi variazioni notevoli fra le varie aree 
geografiche, di cui si deve tener conto quando si procede alle 
effettuazioni di metaanalisi. L’esperienza clinica dimostra che può 
esservi un'eziologia comune alla base di tutte le anomalie osservate. Il 
seminoma e il criptorchidismo, così come l’ipospadia, sono spesso 
associate con un quadro istologico di alterazioni della spermatogenesi. 
Inoltre è noto che il cancro testicolare insorge più frequentemente su 
testicoli ritenuti. Le basi biologiche per la suscettibilità del testicolo agli 
effetti negativi dovuti ad un incremento degli estrogeni risiedono negli 
effetti di questi ormoni sullo sviluppo e la funzione delle cellule del 
Sertoli nel testicolo fetale. La proliferazione e la funzione delle cellule 
del Sertoli sono entrambi fenomeni controllati dall’ormone FSH i cui 
livelli sono, a loro volta, regolati per mezzo di una retroazione 
negativa dal livello di estrogeni. L’FSH stimola la moltiplicazione delle 
cellule del Sertoli e probabilmente regola anche la secrezione 
dell’ormone antimulleriano, responsabile della regressione dei dotti 
mulleriani (primordio embrionale dell’apparato genitale femminile). 
Pertanto, una diminuzione nella secrezione di FSH causata da un 
aumento degli estrogeni nel circolo maternofetale può avere un effetto 
negativo sulla proliferazione delle cellule del Sertoli e sulla secrezione 
dell’ormone antimulleriano. E’ stato suggerito che una alterata 
secrezione di tale ormone può portare sia a differenti tipi di condizioni 
 16 
intersessuali sia al criptorchidismo, dato il suo ruolo nella fase 
addominale della discesa testicolare. Inoltre vi sono alcune evidenze 
che indicano che l’ormone antimulleriano controlla la divisione delle 
cellule germinali primordiali: una insufficiente produzione di tale 
ormone può causare una abnorme proliferazione di cellule germinali e 
quindi potrebbe avere un ruolo nello sviluppo di carcinomi in situ, 
quegli stessi carcinomi in situ che nella vita adulta darebbero luogo al 
seminoma. La moltiplicazione delle cellule del Sertoli è ristretta, in 
gran parte, alla vita fetale e alle prime fasi della vita neonatale ed è 
controllata dalla secrezione di FSH. Ogni cellula del Sertoli può nutrire 
un numero limitato di cellule germinali regolandone lo sviluppo verso 
spermatozoi maturi. Un numero ridotto di cellule del Sertoli è noto 
essere un fattore limitante per la spermatogenesi. Inoltre un anomalo 
funzionamento delle cellule del Sertoli può avere un impatto negativo 
sulle cellule del Leydig e di conseguenza sulla produzione di 
androgeni e il normale processo di sviluppo del fenotipo maschile del 
feto. Le basi biologiche e fisiologiche per un possibile ruolo degli 
estrogeni nelle disfunzioni del tratto genitale maschile sembrano 
quindi esistere. Le argomentazioni proposte non sono in contrasto con 
il dato, ben noto, del significativo fisiologico aumento dei livelli di 
estrogeni materni durante la gravidanza. Infatti gli eventi critici nello 
sviluppo testicolare hanno luogo in un periodo molto precoce dello 
sviluppo fetale, quando l’incremento nei livelli di estrogeni circolanti 
nel sangue materno non ha ancora avuto luogo. Un aumento nei livelli 
basali di estrogeni in questo precoce periodo dello sviluppo può avere 
un effetto deleterio sullo sviluppo degli organi riproduttivi. Inoltre gli 
 17 
estrogeni endogeni sono legati, per mezzo di un legame ad alta 
affinità, alla SHBG (Sex Hormon Binding Globulin) mentre gli 
estrogeni sintetici non lo sono. Quindi gli estrogeni sintetici potrebbero 
produrre effetti biologici rilevanti anche se presenti a basse 
concentrazioni. L’esperienza acquisita con l’estrogeno sintetico DES 
indica un ruolo degli xenoestrogeni nelle alterazioni dell’apparato 
riproduttivo. Tra il 1950 e il 1970 alcuni milioni di donne in gravidanza 
sono state trattate con DES al fine di prevenire l’aborto. Nella prole di 
sesso femminile delle donne trattate con DES si è avuto un 
significativo aumento dell’incidenza di un raro tumore della vagina e 
della cervice uterina, l’adenocarcinoma a cellule chiare. Questi dati 
indicano che l’esposizione durante la gravidanza ad un estrogeno 
sintetico può causare neoplasie nella prole con un periodo di latenza 
notevolmente lungo. In gruppi di soggetti di sesso maschile, figli delle 
donne trattate con DES, sono stati osservati pseudoermafroditismo, 
malformazioni del tratto urogenitale, quali criptorchidismo e 
ipospadia, ed una diminuzione del numero di spermatozoi. Tuttavia 
studi prospettici non hanno messo in evidenza né un deterioramento 
della fertilità né un incremento del rischio di neoplasie testicolari. Le 
evidenze di un progressivo aumento dei livelli di estrogeni ambientali 
durante l’ultimo mezzo secolo, conseguenti alla loro aumentata 
utilizzazione ed emissione nell’ambiente, derivano da varie fonti. Tra 
le diverse modalità di esposizione, quella collegata alle abitudini 
alimentari ha, con molta probabilità, una notevole rilevanza. Il 
consumo di grassi procapite è stato trovato essere correlato in modo 
significativo al tasso di mortalità per il cancro della mammella ed è 
 18 
anche stata avanzata l’ipotesi che la dieta dei paesi industrializzati, 
quando paragonata a diete vegetariane o semivegetariane, sia alla base 
di una maggiore incidenza di altri tumori, oltre quello della 
mammella, cosiddetti ormonodipendenti. In effetti, molti contaminanti 
ambientali, identificati come potenziali ED, si accumulano nei tessuti e 
quindi negli alimenti di origine animale. Per completezza va ricordato 
come, secondo alcuni autori, l’effetto protettivo della dieta vegetariana 
sia proprio dovuto alla presenza di elevate quantità di fitoestrogeni, 
soprattutto isoflavonoidi e lignani. 
 
In quest'ottica, l'Unione Europea, e l'Organizzazione mondiale della 
Sanità hanno patrocinato con programmi specifici ricerche di 
approfondimento dell'argomento. Con il termine di "endocrine 
disruptors" (ED), sono definiti quegli agenti esogeni che interferiscono 
con la produzione, il rilascio, il trasporto, il metabolismo, il legame, 
l'azione o l'eliminazione degli ormoni fisiologicamente presenti 
nell'organismo. Gli inquinanti ambientali e le noxae professionali 
rientrano tra quei fattori che includono anche farmaci, infezioni, 
traumi, stati di stress fisici e/o psichici che possono influire 
sull'equilibrio del sistema endocrino attraverso molteplici meccanismi 
fisiopatologici. 
 
Gli ormoni sono molecole liberate da organi endocrini nella 
circolazione sanguigna; da qui raggiungono uno o più tessuti 
bersaglio, dove svolgono la loro azione. Cellule secernenti ormoni si 
trovano anche in organi, la cui funzione principale non è quella 
 19 
endocrina, quali cuore, tubo gastrointestinale e reni. chimicamente gli 
ormoni possono essere proteine, per esempio l'ormone della crescita 
(GH), aminoacidi quali triiodotironina (T3) e tetraiodotironina (T4) o 
steroidi quali il cortisolo ed il testosterone. Le modificazioni del 
sistema endocrino possono essere valutate misurando la 
concentrazione sierica di singoli ormoni, in condizioni sia basali sia 
dinamiche (cioè a seguito di stimolazioni o inibizioni specifiche) . 
 
Metalli, idrocarburi e agenti fisici possono indurre modificazioni 
dell'equilibrio ipotalamoipofisario. In particolare in studi condotti in 
vitro e in vivo, è stato evidenziato che elevate concentrazioni di zinco 
(Zn) e Manganese (Mn), diminuiscono la secrezione basale, ma non 
quella TRHstimolata, di tireotropina (TSH). L'esposizione prolungata a 
basse dosi di Mn determina l'incremento della secrezione di Prolattina. 
Il Piombo (Pb) compromette la secrezione dell'ormone della crescita 
(GH) e delle gonadotropine (LH, FSH). Secondo alcuni studi, 
l'esposizione a Pb determina anche iperprolattinemia. Il Cadmio (Cd) 
agisce specificatamente sull'asse ipotalamoipofisario nella regolazione 
della prolattina, ACTH, GH. Anche il mercurio (Hg) ed il Bromo (Br) 
possono alterare la funzione del TSH: il primo riducendolo, il secondo 
determinando incostantemente un aumento. I solventi modificano la 
funzione ipotalamoipofisaria come ampiamente dimostrato da studi 
effettuati su stirene, benzene, toluene, percloroetilene. 
In soggetti occupazionalmente esposti a stirene è stato osservato un 
incremento dei livelli sierici di prolattina e GH, con FSH ed LH 
invariati.