Effetto in vitro dei metalli pesanti piombo e mercurio sull'attività dell'enzima fosfolipasi C nelle branchie e nel mantello del mollusco marino Mytilus galloprovincialis Lmk

 2
1.6 µg∗g
-1
). Also, in sea mussel samples from the same coastal site, the in 
vitro effect of Pb
2+
 ions, added as an exogenous source of soluble salts 
(lead nitrate) on two different protein targets within the mantle tissue, the 
peripheral benzodiazepine receptor (PBR) and the widespread signal 
transduction pathway of adenylyl cyclase (AC), have been estimated. 
Results revealed a strong inhibitory effect of Pb
2+
 on these two biochemical 
“markers” (Betti et al, 2003; Giannaccini et al, data submitted for 
publication). The present study consisted in an extension of the 
aforementioned work, evaluating the in vitro effect of Pb
2+
 ions on another 
signaling pathway protein, phospholipase C (PLC), in soft tissues of 
Mytilus galloprovincialis Lmk., collected from Forte dei Marmi.  PLC is a 
membrane-anchored enzyme, whose activity induces the formation of the 
intracellular second messengers, IP
3
 (inositol-1,4,5-triphosphate) and DAG 
(diacilglycerol) from PIP
2
 (phosphatidylinositol-4,5-biphosphate). Besides 
lead ions, the effects of mercury ions have been also investigated in this 
model. So we proceeded in the assessment of PLC enzyme activity in the 
mantle and gills of Mytilus galloprovincialis Lmk., treated or not with these 
metals, as free cations.  
Samples of Mytilus galloprovincialis Lmk., sized between 2-4 cm, have 
been collected from the non-polluted site (Forte dei Marmi). Mussels has 
been transported in bags containing sea local water up to the laboratory. 
Mussels have been immediately opened, gills and mantles removed and 
 3
homogenized in a 30 mM Hepes-NaOH buffer, containing the protease 
inhibitor leupeptine, accordingly to the method of Panfoli et al. (1993). 
PLC assay consisted in the incubation of tissue homogenate for 10-15 
minutes at 19°C in presence of an exogenous sub-layer, represented by 
radio-labeled substrate, [
3
H]-PIP
2,
 and an unlabeled mixture of 
phosphoinositides (20-30 % PIP/PIP
2
) (De Vivo, 1994). Increasing 
concentrations of mercury chloride, HgCl
2
, and lead nitrate, Pb(NO
3
)
2
, 
were used as the source of free lead and mercury cations.  
Results showed a measurable PLC enzyme activity on both homogenates 
from gills and mantles of Mytilus galloprovincialis Lmk., which was higher 
in gills than in mantles. Mercury ions revealed a significant inhibition of 
enzymatic activity on both tissues under investigation at concentrations 
between 10-100 µM, reaching more than the 50% max. inhibition at 50 
µM. Lead ions displayed only a weak inhibitory effect  (≅ 17 % max. ) at 
the concentration of 100 µM in gills and mantles. Lead nitrate was able to 
completely inhibit PLC activity only at concentrations ranging from 10-20 
mM, reaching the 50% max. inhibition at about 1 mM.  
Nevertheless, a pre-incubation for 30-35 minutes at 19°C in a shaking bath 
of the gill homogenate in the presence of 10-100 µM lead nitrate and 
isotonic Hepes buffer (containing 120 mM KCl), significantly increased 
enzyme inhibition by this metal.  
 4
Moreover, the chelating agent β-mercaptoethanol was able to reverse both 
lead and mercury-induced inhibition of PLC activity.  
These results suggests that lead and mercury free cations are able to alter 
enzyme PLC activity in both tissue, even if with a different potency. The 
enhanced inhibition observed with pre-incubation in the presence of  lead, 
indicates that these metals not only may directly alter the enzyme 
conformation, presumably by interacting with cysteine –SH groups, but 
also may provoke the time-dependent formation of toxic oxyradical 
species.  
 5
RIASSUNTO 
 
Gli inquinanti di origine antropica e naturale presenti a livello marino e 
costiero quali ad esempio i  metalli pesanti, fra cui il piombo e il mercurio, 
hanno incentivato gli studi volti a determinare gli effetti di questi elementi 
sul metabolismo degli organismi marini. A riguardo, data la sua notevole 
capacità di filtrare l’acqua marina e di accumulare nei suoi tessuti molli 
inquinanti di vario genere, il bivalve marino Mytilus galloprovincialis 
Lmk., facilmente reperibile a livello della costiera mediterranea, potrebbe 
risultare molto utile. Tale mollusco è stato oggetto di numerose ricerche 
che lo hanno utilizzato come bioindicatore delle concentrazioni di metalli 
pesanti nelle acque marine. Inoltre, i mitili rappresentano 
un’importantissima risorsa alimentare e commerciale, per cui è 
comprensibile un’attività di ricerca che monitori il loro stato di salute al 
fine sia di salvaguardare questa specie sia  di garantire la salute umana. 
Anche se questi animali sono in grado di sopravvivere in ambienti marini 
inquinati, resistendo persino a dosi subletali di metalli pesanti, non è 
escluso che il loro  metabolismo possa essere alterato durante l’esposizione 
in acuto e in cronico a questi inquinanti.  
Nel nostro laboratorio sono stati preliminarmente effettuati  studi di 
determinazione della concentrazione di  piombo (Pb) nei tessuti molli di 
Mytilus galloprovincialis Lmk. prelevato da un sito costiero del Mar 
 6
Tirreno (Forte dei Marmi), rilevando concentrazioni di questo metallo nella 
norma (1-1.6 µg.g
-1
). Quindi, in questi stessi campioni di mitili, è stato 
valutato l’effetto in vitro di ioni Pb
2+
 aggiunti in forma di sale solubile 
(nitrato di piombo) su due proteine “target” presenti nel mantello, il 
recettore periferico delle benzodiazepine (PBR) e l’enzima adenilato ciclasi 
(AC), una delle vie di trasduzione del segnale più diffusa nelle cellule. I 
risultati hanno rivelato una potente inibizione degli ioni Pb
2+
 in entrambi 
questi “markers” biochimici (Betti et al., 2003; Giannaccini et al., dati 
sottoposti a  pubblicazione). Il presente studio consisteva nell’estensione 
del precedente lavoro, andando a valutare l’effetto in vitro degli ioni Pb
2+
 
su di un altra proteina di trasduzione del segnale, la fosfolipasi C (PLC), la 
cui attività provoca la formazione dei secondi messaggeri intracellulari IP
3
 
(inositolo-1,4,5-trifosfato) e DAG (diacilglicerolo) a partire da 
fosfatidilinositolo-4,5-bifosfato (PIP
2
) o fosfatidilinositolo 4-fosfato  (PIP).  
Oltre agli ioni Pb
2+
 sono stati anche valutati  gli effetti degli ioni mercurio 
(Hg
2+
). Si è cosi proceduto alla determinazione dell’attività dell’enzima 
PLC in preparazioni di mantello e branchie di Mytilus galloprovincialis 
Lmk, trattati e non con questi metalli.  
Campioni di mitilo di lunghezza compresa tra 2 e 4 cm sono stati prelevati 
dal sito non inquinato con metalli pesanti (Forte dei Marmi). I mitili sono 
stati trasportati in taniche contenenti acqua di mare del luogo fino al 
laboratorio. I mitili sono stati immediatamente aperti e le branchie e i 
 7
mantelli rimossi e omogeneizzati in un tampone ipotonico 30 mM Hepes-
NaOH, contenente l’inibitore delle proteasi leupeptina, in accordo alla 
procedura di Panfoli et al (1993). Il metodo di valutazione della PLC 
utilizzato consisteva nell’incubazione del preparato di tessuto per 10-15 
min. a 19°C in presenza di micelle di substrato esogeno, rappresentato da 
una componente radio-marcata, [
3
H]-PIP
2 
e una componente non marcata 
rappresentata da una miscela di fosfoinositidi (20-30% PIP/PIP
2
) (De Vivo, 
1994). Come fonte degli ioni mercurio e piombo sono state utilizzate 
soluzioni di cloruro mercurico (HgCl
2
) e di piombo nitrato (Pb(NO
3
)
2
) a 
concentrazioni crescenti. 
I risultati hanno mostrato che sia sulle branchie che sul mantello del 
Mytilus galloprovincialis Lmk. era rilevabile un’attività dell’enzima PLC, 
maggiore nelle branchie rispetto al mantello. Gli ioni mercurio hanno 
rilevato un’importante inibizione dell’attività enzimatica sia nelle branchie 
che nel mantello dell’animale a concentrazioni comprese tra 10 e 100 µM, 
raggiungendo un valore maggiore del 50% della massima inibizione a 50 
50 µM. Gli ioni piombo hanno invece inibito (≅ 17 % max.) l’enzima nei 
due tessuti in esame alla concentrazione di 100 µM. Il piombo nitrato era 
capace di inibire completamente l’attività della PLC solo a concentrazioni 
comprese tra 5-20 mM, raggiungendo il 50% dell’inibizione massima a 
circa 1 mM. Tuttavia, la pre-incubazione per 30-35 min a 19°C in 
agitazione dell’omogenato di tessuto (branchie) in presenza di piombo 
 8
nitrato 10-100 µM e in un tampone Hepes isotonico (contenete 120 mM 
KCl), ha incrementato in modo significativo l’inibizione sull’enzima di 
questo metallo.  
Inoltre, l’agente chelante β-mercaptoetanolo era in grado di recuperare 
l’inibizione indotta sia dal piombo che dal mercurio sull’attività della PLC.  
Questi risultati suggeriscono che i cationi liberi del piombo e del mercurio 
sono in grado di alterare l’attività dell’enzima PLC in entrambi i tessuti, 
seppur con una diversa potenza. L’aumento di inibizione osservato con la 
pre-incubazione in presenza di piombo, indica che questi metalli non solo 
possono alterare direttamente la conformazione dell’enzima, 
presumibilmente attraverso l’interazione con i gruppi –SH delle cisteine, 
ma possono anche provocare la formazione tempo-dipendente di specie 
tossiche di ossiradicali.  
 9
CAPITOLO 1 
 
 
 
MYTILUS GALLOPROVINCIALIS LMK. 
 
 
 
1.1 “Carta di identità” del mollusco marino Mytilus galloprovincialis 
Lmk. 
 
 
 
 
 
Figura 1.1: esemplare di Mytilus galloprovincialis Lmk. 
 
 
 
 
 
PHYLUM:  Mollusca 
 
CLASSE:   Bivalva  
 
SOTTOCLASSE: Pteriomorpha 
 
ORDINE: Mytilida 
 
FAMIGLIA: Mytilidae 
 
SPECIE: Mytilus galloprovincialis Lmk. (1819) 
 10
1.2 Biologia di Mytilus galloprovincialis Lmk. 
 
 
 
I Molluschi, dopo gli insetti, costituiscono il phylum più numeroso del 
regno animale, con oltre 150.000 specie classificate; di queste il 70 % sono 
marine, il resto terrestri o dulciacquicole.  
Tale phylum comprende organismi di vario genere, dagli erbivori 
raschiatori ai parassiti. Mytilus galloprovincialis Lmk. appartiene alla classe 
dei Bivalva i cui esemplari sono filtratori, nutrendosi di particelle organiche 
in sospensione e di plancton. Comune nelle zone di marea, il mitilo 
colonizza qualsiasi corpo naturale o artificiale sommerso nell’infralitorale 
ed è un organismo coloniale. Infatti lo si può ritrovare in aggregati molto 
numerosi. Come tutti i bivalva, anche i mitili sono animali protetti da una 
conchiglia composta da due parti simmetriche, le valve che si aprono e si 
chiudono in base alle necessità dell’animale. La lunghezza varia tra i 5 e i 
15 cm allo stadio adulto. La forma è pressoché triangolare e la colorazione 
della conchiglia è generalmente nera, ma può assumere delle sfumature 
bluastre. Internamente ogni valva presenta un sottile strato madreperlaceo: 
                       
Figura 1.2: le valve