Effetto della quantità di carica sulle proprietà strutturali e sulla stabilità di quadrieliche di guanosine: analisi mediante diffrazione dei raggi X

II
Finalità della tesi
conformazioni più disordinate, attraverso le quali vengono ridotte, per
rotazione di una colonna rispetto ad un’altra, le interazioni intermolecolari
repulsive, prevalentemente di tipo elettrostatico. Generalmente quindi le
quadrieliche di guanosina formano strutture di tipo esagonale a bassa
idratazione, mentre la transizione alla fase colesterica è determinata
dall’aumento del contenuto d’acqua. Un altro aspetto da considerare è che
la formazione delle quadrieliche mostraunafortedipendenzadala
presenza in soluzione di cationi alcalini, indicando una peculiare specificità
ionica nella stabilizzazione dei tetrameri. Infatti, ogni catione tende ad
occupare la cavità centrale dell’aggregato colonnare attraverso la
coordinazione con gli otto atomi di ossigeno di due tetrameri successivi. I
sistemi formati dalle quadrieliche di guanosine sono oggetto di un forte
interesse biologico, dato che la formazione di tali strutture è stata messa in
relazione con certe proprietà biofisiche della cromatina e dei telomeri, con
il meccanismo d'azione di alcuni farmaci antitumorali, e addirittura con
l'origine prebiotica della molecola di DNA. E quindi, allo scopo di ottenere
informazioni ulteriori sulle proprietà strutturali, sull’autoassemblaggio,
sulla stabilità e sulle interazioni tra gli aggregati colonnari, in questa tesi
vengono analizzate le proprietà strutturali e le interazioni in quadrieliche
modello con la particolare intenzione di valutare quale influenza abbia
sulle proprietà strutturali e sul comportamento liotropico di tali sistemi, la
III
Finalità della tesi
quantità di carica negativa netta distribuita lungo gli aggregati cilindrici.
L’idea è stata quella di poter variare la densità di carica negativa esposta
superficialmente dagli aggregati colonnari, e cioè il numero di cariche per
unità di lunghezza, modificando, nella preparazione dei campioni, il
rapporto molare tra la guanosina 5’-monofosfato e la guanosina. Infatti la
guanosina 5’-monofosfato è un derivato della guanosina che tende ad
esistere in soluzione acquosa, a pH normale, come anione per la presenza
del fosfato carico negativamente, mentre la guanosina è elettricamente
neutra. Esperimenti di diffrazione dei raggi X sono stati condotti su
soluzioni acquose a differente percentuale in peso della sola GMP-NH
4
+
ed inoltre si sono investigati i sistemi costituiti da quadriplessi derivati da
miscele della guanosina 5’-monofosfato (GMP), nella forma di sale di
ammonio, con la guanosina (G). Gli esperimenti di diffrazione dei raggi X,
effettuati ad Ancona e al Sincrotrone Elettra di Trieste, hanno messo in
evidenza che le miscele acquose di questi due componenti danno origine a
quadrieliche stabili derivate dall’impilamento di tetrameri a costituzione
bimolecolare in cui residui di guanosina 5’-monofosfato sono legati a
residui di guanosina. Si è proceduto, per tutti i campioni, con la
caratterizzazione strutturale delle diverse fasi liotropiche (isotropa,
colesterica ed esagonale) e con la definizione del loro dominio di esistenza,
variando la temperatura, la concentrazione e la pressione, in modo da poter
IV
Finalità della tesi
avere, attraverso il confronto dei differenti sistemi, un’indicazione circa gli
effetti sulle proprietà strutturali dipendenti dalla carica laterale distribuita
sulle colonne. Campioni GMP-NH
4
+
formano aggregati colonnari in cui la
densità di carica negativa superficiale è la massima possibile per la
presenza nella costituzione dei tetrameri impilati della sola guanosina 5’-
monofosfato. Mentre l’evidenza dell’esistenza delle fasi liotropiche anche
per i campioni costituiti da soluzioni acquose della miscela GMPNH
4
+
/G
nei rapporti molari 7:1, 3:1 e 1:1 dimostra chiaramente la formazione di
quadrieliche in cui la densità di carica superficiale è proporzionale al
numero dei residui di GMP. I profili di diffrazione ai raggi X relativi a
questi campioni ci hanno consentito di determinare, sia i domini di
esistenza delle fasi liotropiche dipendenti dalla temperatura e dalla
pressione idrostatica, rappresentati in un diagramma di fase, sia di
raccogliere dati strutturali relativi alla distanza della cella unitaria e alla
distanza tra i dischi tetramerici impilati. Il lavoro che si è rivelato intenso
e affascinante è scaturito dall’ intenzione di voler contribuire, in misura
modesta, alla raccolta di evidenze che continuano ad accumularsi
sull’argomento che, come detto, mostra di avere una notevole rilevanza
biologica. Infatti merita una particolare attenzione una singolare proprietà
che è stata messa in luce recentemente in alcuni telomeri di DNA: a causa
del numero elevato di residui guanosinici, le code telomeriche sono in
VFinalità della tesi
grado di autoassociarsi per formare delle quadrieliche. Tali quadrieliche
hanno alcune proprietà biologiche (come quella di favorire il corretto
appaiamento di molecole di DNA durante la meiosi o di stabilizzare le
interazioni durante l'appaiamento dei cromatidi), anche se l'origine delle
interazioni, la caratteristica stabilità di tetrameri di guanosina e le proprietà
fisiche di tali sistemi sono ancora ben lontane dall’essere chiarite
completamente.
11. Introduzione
1.1 Proprietà della guanosina
La guanina (2-amino-6-ossipurina), con la citosina, l’adenina, la timina e
l’uracile è una della cinque basi azotate che costituiscono il DNA e l’RNA.
In forma libera o combinata, queste basi si trovano in quantità apprezzabile
nella maggior parte delle cellule, in genere come prodotti di idrolisi
enzimatica. Come tutte le basi, anche la guanina ha caratteristiche
debolmente basiche, è relativamente insolubile in acqua ed ha un forte
assorbimento nella zona dell’ ultravioletto (da 250 a 280 nm). La guanina
insieme alla adenina è una base purinica cioè una molecola aromatica
piatta costituita da due anelli, mentre la citosina, la timina nel DNA e
l’uracile nell’ RNA, sono basi pirimidiniche cioè molecole aromatiche
piatte a singolo anello. A costituire lo scheletro di DNA ed RNA, le basi
azotate sono legate mediante un legame ß-N glicosidico ad uno zucchero
pentoso chiamato riboso nell’RNA e deossiriboso (privo in posizione 2’
del gruppo idrossile presente invece nel riboso) nel DNA (Fig. 1.1).
L’insieme della base purinica e dello zucchero a cinque atomi di carbonio è
detto nucleoside e, nel caso in cui la base azotata sia la guanina, si parla di
ribonucloside (guanosina) nell’RNA e di deossiribonucleoside (2’-
deossiguanosina) nel DNA. In posizione 5’ ogni nucleoside può essere
legato mediante legame fosforico ad uno, due o tre gruppi fosfato
prendendo così il nome di nucleotide mono-di e trifosfato rispettivamente.
2Introduzione
Figura 1.1 Molecole di 2’- deossiguanosina 5’ monofosfato (a sinistra) e guanosina
5’- monofosfato (a destra): le due molecole differiscono esclusivamente per la presenza
del gruppo ossidrilico in posizione 2’ dello zucchero.
Sia nel DNA che nell’RNA i nucleotidi trifosfato sono uniti da legami
covalenti fosfodiesterici che congiungono il gruppo fosfato di un
nucleotide a un gruppo ossidrilico dello zucchero del nucleotide adiacente.
Dei cinque nucleotidi purinici e pirimidinici presenti nel DNA e nell’RNA
solo la guanosina 5’- monofosfato (GMP) e l’analogo deossiribonucleoside
presentano la capacità, in acqua, di autoassociarsi in strutture stabili con la
conseguente formazione di fibre e gels (Gellert et al., 1962; Saenger, 1984;
Gushlbauer et al., 1974). Attraverso esperimenti di diffrazione dei raggi X
è stato dimostrato che la componente comune di questi prodotti di
autoaggregazione è un quartetto planare a forma di disco (complesso
tetramerico) costituito da quattro residui guanilici (Fig. 1.2) legati fra loro
mediante legami a ponte idrogeno di tipo Hoogsteen (Hoogsteen, 1959;
3Introduzione
Figura 1.2 Tetramero formato da quattro residui di guanosina legate fra loro
mediante legami a ponte idrogeno di tipo Hoogsteen.
Saenger, 1984). Strutture ordinate in fase isotropa e gels ordinati erano già
stati osservati in passato; molto recentemente è stato evidenziato anche un
ricco polimorfismo liotropico che include la formazione di fasi liquido-
cristalline esagonali e colesteriche rispettivamente ad alta e bassa
concentrazione (Mariani et al., 1989, 1993; Bonazzi et al., 1991; Amaral et
al., 1992; Gottarelli & Spada, 1996, 1997). Anche queste strutture hanno
come unità strutturale di base quartetti (tetrameri) planari a forma di disco
legati tra loro da legami idrogeno secondo lo schema di Hoogsteen. I dischi
hanno un diametro di circa 25 Å e, a causa delle loro proprietà anfifiliche,
tendono ad impilarsi uno sull’altro ad una distanza di 3.4 Å (che è la stessa
4Introduzione
distanza tra le basi appaiate nel DNA), formando dei macro-aggregati
cilindrici in cui gli zuccheri e i fosfati (la parte idrofilica) sporgono
all’esterno (Fig. 1.3a). Attraverso esperimenti di diffrazione dei raggi X,
microscopia ottica e dicroismo circolare è stata dimostrata la natura
colonnare delle fasi liquido cristalline formate dalla guanosina e dai suoi
derivati (Mariani et al., 1989; Spada et al., 1988; Bonazzi et al., 1991). E'
importante osservare che in ciascuna colonna i tetrameri non sono impilati
esattamente uno sull’altro, ma ciascuno è ruotato rispetto all’altro di circa
35-45° (Fig. 1.3b), formando una quadrielica destrorsa, molto simile alle
quadrieliche di poli(G) (Arnott et al., 1974; Zimmermann et al., 1975).
Figura 1.3 Vista laterale (sinistra) e dall’alto (destra) dei tetrameri di guanosina.
I dischi non sono impilati in registro ma sono ruotati l’uno rispetto all’altro in modo
tale da formare una vera e propria quadrielica.
5Introduzione
Un'altra caratteristica molto importante delle strutture formate dalla
guanosina è che i tetrameri, e quindi le quadrieliche, sono stabilizzati da
cationi monovalenti: in particolare, la risonanza magnetica nucleare ha
fornito l’evidenza che i cationi sono parte integrale dell’associazione
tetramerica della guanosina tendendo ad occupare la cavità centrale del
tetramero (Fig. 1.4a). Tuttavia, la stabilizzazione è differente a seconda del
tipo di catione legato (Fisk et al., 1978; Detellier & Lazlo, 1980; Bonazzi
et al., 1991; Mariani et al., 1993; Gottarelli & Spada, 1989). Questo effetto
è stato spiegato considerando che, per favorire l’aggregazione, le
dimensioni del catione che si lega al tetramero devono essere tali da
permettergli di occupare la cavità centrale.
Figura 1.4 Stabilizzazione dei tetrameri di guanosina determinata dalla presenza di
cationi alcalini (NH
4
+
) i quali possiedono dimensioni tali da poter occupare la cavità
centrale del tetramero (a). I cationi sono condivisi da due tetrameri successivi
mediante coordinazione da parte degli otto ossigeni chetonici delle guanosina (b).
6Introduzione
Ciascun catione è coordinato da quattro ossigeni chetonici di ciascun
tetramero, occupando la cavità centrale in modo tale da essere condiviso
tra due tetrameri successivi (Fig. 1.4b). Per quanto riguarda la natura dei
cationi è stato osservato che Na
+
,NH
+
4
eK
+
(in particolare questi due
ultimi) hanno le dimensioni idonee per poter occupare la cavità centrale ed
essere coordinati contemporaneamente da otto atomi di ossigeno (Detellier
& Lazlo, 1980; Sen & Gilbert, 1991; Franz et al., 1994). La rilevanza
biologica della prerogativa della guanosina di autoassociarsi in
quadrieliche è tuttora discussa; lavori recenti hanno mostrato come tratti a
singolo filamento nel DNA telomerico, tendono a formare in vitro
naturalmente strutture di ordine più elevato. Queste, non sarebbero altro
che quartetti di guanosina legati insieme secondo il modello di Hoogsteen
tramite legami a ponte idrogeno (Fig. 1.2). E’ stato quindi osservato che la
formazione di quadruplessi è in qualche modo in relazione alla
dimerizzazione delle code telomeriche nei cromosomi (Sundquist & Klug,
1989; Sen & Gilbert, 1989) e che la formazione di queste strutture in
regioni del cromosoma ricche di G, come i telomeri, possa essere correlata
all’allineamento dei cromosomi omologhi durante la meiosi (Sen &
Gilbert, 1989). In maniera simile è stato ipotizzato che tali strutture
costituiscano un meccanismo generale per allineare due duplex durante la
ricombinazione (Sundquist & Klug, 1989) e che questi tetrameri siano il
substrato naturale dell’enzima telomerasi fornendo interessanti spunti nella
7Introduzione
terapia antitumorale (Ceck et al., 1990 Zahler et al., 1989). Probabilmente i
primitivi cromosomi potrebbero aver sfruttato questa proprietà generale
della guanosina di mediare la formazione di quadriplessi, per auto-
associarsi e scambiare informazione genetica in assenza di proteine
specializzate (Detellier & Lazlo, 1980; Sen & Gilbert, 1991). Non si hanno
informazioni definitive circa la funzione in vivo di tali strutture, ma la
conservazione nel corso dell’evoluzione di tali sequenze ricche in guanina
nelle code telomeriche, ne fa ipotizzare l’effettiva esistenza.
1.2 Struttura del DNA telomerico
I telomeri sono stati definiti funzionalmente sulla base dei primi studi
genetici e citologici i quali dimostravano che i cromosomi con estremità
troncate erano instabili. Le estremità tronche infatti avevano la capacità di
fondersi le une con le altre dando origine a cromosomi dicentrici, anelli o
ad altre forme cromosomiche anomale. Ciò ha permesso di dedurre che il
telomero è una struttura specializzata, tipica delle estremità dei cromosomi
eucariotici, fondamentale per la loro stabilità e integrità. La sequenza del
DNA telomerico è fortemente conservata, anche tra organismi eucariotici
molto differenti e consiste in tratti ripetuti in tandem. Esempi di unità
ripetute includono AGGGTT per umani, altri vertebrati e tripanosomi;
GGGGTT e GGGGTTTT per protozoi ciliati come Tetrahymena (Fig. 1.5)
8Introduzione
Euplotes, Oxytricha (Fig. 1.6); AGGGTT(C/T) per il Plasmodium della
malaria; G
(1-3)
T per i lieviti da pane. La caratteristica tipica dei telomeri è
quella di possedere all'estremità 3' in direzione 5'-3', un tratto di DNA a
singolo filamento ricco in G che protrude con 12-16 nucleotidi. E' stato già
dimostrato che sequenze oligonucleotidiche ricche in G con la stessa
sequenza di quella telomerica che protrude con 12-16 basi, sono in grado
di formare in vitro una gran varietà di strutture che coinvolgono
appaiamenti di basi G-G (Blackburn et al., 1989; Raghuraman & Check,
1990; Henderson et al., 1987; Williamson et al., 1990). In questo caso gli
oligonucleotidi sono troppo corti per dare origine a quadruplessi
intramolecolari: si costituisce allora una quadrupla elica di guanosina
intermolecolare, cioè che coinvolge residui di guanosina che appartengono
a catene diverse. Se invece si considerano oligonucleotidi più lunghi,
questi danno origine ad una struttura intramolecolare stabilizzata da legami
di tipo Hoogsteen tra i residui di guanosina appartenenti alla stessa
molecola
(Fig. 1.8) ( Kang
et al. 1992; Smith & Feigon 1992; Miura &
Thomas, 1994). Come si può osservare in figura 1.7, nel primo caso, quello
dell’appaiamento intermolecolare, i quattro filamenti che si associano per
dare origine ai quadruplessi sono orientati parallelamente mentre, nel
secondo caso, quello intramolecolare, l’orientazione è obbligatoriamente
antiparallela. (Sen & Gilbert, 1990; Jin et al., 1990; Wang & Patel, 1992).