Effetto della nicotina sulla replicazione di Mycobacterium tuberculosis: possibile utilizzo come farmaco antitubercolare

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CAPITOLO  2  
SCOPO DELLA DISSERTAZIONE 
Il razionale per l eventuale sviluppo di questa ricerca poggia su 
tre considerazioni: 
1) L elevata incidenza e prevalenza della tubercolosi nel 
mondo. Infatti i flussi migratori da Cina, India, ex URSS, 
Africa sub-sahariana e l’infezione da HIV stanno provocando 
un ritorno consistente di infezioni da Micobatteri patogeni, 
soprattutto da MTB, con alta mortalit  e caratteri clinici 
nuovi in quanto spesso associate ad altre patologie. L OMS 
stima che circa un 1/3 della popolazione mondiale abbia una 
infezione tubercolare latente (ITLB), 14 milioni siano i 
soggetti con una infezione attiva e 2 milioni siano i decessi 
annui. 
2) Il crescente numero di forme tubercolari farmaco-resistenti 
(MDR).  
3) La mancanza di nuovi antitubercolari disponibili, soprattutto 
se si considera che l ultimo antibiotico antitubercolare, la 
rifampicina, ha visto la luce a met  anni sessanta.  Ci  Ł 
dovuto evidentemente ad un discutibile disimpegno delle 
Case Farmaceutiche in questo campo specifico che costringe 
i clinici, di fronte all avanzare di forme sempre piø resistenti, 
ad affiancare ai farmaci di prima linea quelli di seconda.  
CAPITOLO  2  -  SCOPO DELLA DISSERTAZIONE 
 
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In questo scenario quindi la nicotina potrebbe essere un buon 
candidato nella lotta alla tubercolosi in affiancamento alla 
chemioterapia multipla specifica. 
Scopo di questa tesi Ł quello di verificare in vitro, l effetto 
della nicotina, su ceppi di M. Tuberculosis, precedentemente 
saggiati per sensibilit  ai farmaci di prima linea.   
 
A tale scopo abbiamo studiato  10 ceppi di M. Tuberculosis 
isolati da pazienti con TBC sensibile ai farmaci di prima linea e 
per 2 ceppi di M. Tuberculosis isolati da pazienti con TBC 
multifarmacoresistente, ed Ł stata valutata la minima 
concentrazione inibente (MIC)3 per  ciascun ceppo.  
Nel caso in cui trovassimo che la nicotina ha un effetto in vitro 
sulla replicazione di M. Tuberculosis, prospettive di questo 
studio potranno essere quello di sviluppare una terapia in vivo a 
cessione lenta controllata, per garantire nel sangue e nei tessuti la 
MIC, avvalendosi di cerotti NRT gi  in commercio, u na volta 
stabilita la posologia/die standard necessaria a raggiungere la 
MIC e MCB4 a livello delle lesioni. 
 
 
 
 
 
                                           
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 MIC: Minimum Inhibiting Concentration - Concentrazione Minima Inibente; la 
sensibilit  del microrganismo nei confronti dell an tibiotico Ł espressa come la piø 
alta diluizione (cioŁ la piø bassa concentrazione) di antibiotico capace di inibire 
completamente la crescita del microrganismo stesso. 
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 MBC: (Minimum Bactericidal Concentration; minima concentrazione battericida) 
La concentrazione piø bassa del composto in esame necessaria per provocare la 
morte di piø del 99.9% di un dato organismo. 
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CAPITOLO  3  
MATERIALI E METODI 
3.1 Diagnosi microbiologica 
3.1.1 Esame microscopico 
La prima indicazione della presenza o meno di bacilli alcool-
acido resistenti (BAAR) in un campione Ł data dall  esame 
batterioscopico, ovvero dall  osservazione al microscopio, con 
obiettivo 100X in immersione, di un vetrino allestito dal 
campione stesso e colorato con la colorazione di Ziehl-Neelsen . 
Colorazione di Ziehl-Neelsen 
1) trattare il preparato, precedentemente fissato al calore, con 
fucsina fenica (carbolfucsina) riscaldando il vetrino fino a 
quando dalla soluzione colorante non fuoriescano vapori 
visibili. 
2)  lavare con acqua di fonte e decolorare per 30-60 secondi con 
una soluzione di HCl al 3% in alcool etilico soluzione alcool-
acida 
3) lavare nuovamente con acqua di fonte ed effettuare una 
colorazione di contrasto con blu di metilene (vedi [25]). 
CAPITOLO  3  -  MATERIALI E METODI 
 
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Solo i micobatteri trattengono il colore rosso della fucsina dopo 
il trattamento mentre tutti gli altri materiali vengono decolorati 
dalla soluzione alcool-acida e sono ricolorati in blu dalla 
colorazione di contrasto (vedi Figura 3-1).  
I micobatteri sono quindi apprezzabili come bacilli rossi in 
campo blu (vedi [1]). L alcool-acido resistenza Ł dovuta alla 
formazione di aryl-metano-micolati tra la fucsina e gli acidi 
micolici presenti nella membrana cellulare. Con questo tipo di 
colorazione si evidenziano tutti i bacilli alcool-acido resistenti 
(BAAR) quindi anche tutti quei batteri che possiedono 
caratteristiche di membrana simili ai micobatteri (ad es. Nocardia 
spp.: vedi [15]). 
Si deve quindi procedere con l esame colturale per riuscire ad 
isolare il ceppo batterico. 
3.2 Trattamento del campione 
Digestione, decontaminazione, concentrazione 
secondo procedura MGIT 960 
I campioni per la ricerca dei Micobatteri vanno raccolti prima 
della terapia antimicobatterica in contenitori in plastica sterile, 
Figura 3-1: Bacilli alcool-acido resistenti in uno striscio di espettorato  
dopo colorazione di  Ziehl-Neelsen. 
CAPITOLO  3  -  MATERIALI E METODI 
 
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con tappo a vite. La raccolta va eseguita nel modo piø asettico 
possibile per evitare la contaminazione con altri germi. Una volta 
raccolti i campioni vanno inviati al laboratorio prima possibile, 
per garantire la sopravvivenza dei BK ed evitare la 
moltiplicazione di altri microorganismi contaminanti. Al limite 
possono essere conservati a +4 C (tranne le emocolt ure che 
vanno conservate a temp. ambiente) per un max di 48 ore. 
I campioni biologici che normalmente contengono flora 
batterica necessitano di decontaminazione prima della semina, 
allo scopo sia di eliminare la presenza di contaminanti (flora 
batterica associata), sia di fluidificare un materiale 
particolarmente mucoso come, ad esempio, l escreato. In seguito 
a questo trattamento i germi comuni vengono uccisi, mentre i 
Micobatteri, grazie alla loro resistenza ad acidi e basi forti (per 
via di una parete ricca di acidi grassi a lunga catena detti ac. 
micolici), resistono. I campioni in cui non Ł normalmente 
Figura 3-2: Trattamento del campione dall arrivo al laboratorio alla semina. 
CAPITOLO  3  -  MATERIALI E METODI 
 
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presente flora batterica associata, es. liquido cefalo rachidiano, 
sangue, campioni chirurgici e biopsie, non vengono sottoposti a 
trattamento decontaminante. 
Il metodo di riferimento per la decontaminazione dei BK Ł 
quello che utilizza N-acetil-L-cisteina (NALC) e NaOH. 
L NACL Ł un agente mucolitico che ha la funzione di fluidificare 
la matrice mucosa dei campioni biologici; la decontaminazione 
vera e propria Ł operata dall NaOH. L uso dell agente mucolitico 
serve per  per ridurre la quantit  di agente decont aminante da 
usare ed evitare perci  che questo possa essere les ivo anche sui 
Micobatteri.  
I campioni che giungono al laboratorio vanno trasportati e 
maneggiati secondo le modalit  stabilite o secondo il 
regolamento vigente nel laboratorio locale.  
Nel caso di materiali particolarmente muco-purulenti, si pu  
anche facilitare la fluidificazione, che ha lo scopo di liberare i 
batteri dal muco, aggiungendo un piccola quantit  d i un agente 
fluidificante (ad es. sputasol o fluimucil). 
Una volta sottoposti a digestione, decontaminazione e 
concentrazione, i campioni vanno sottoposti 
contemporaneamente e rigorosamente a coltura liquida e solida 
(vedi [26]). 
3.3 Esame colturale 
Si procede successivamente alla semina contemporanea in 2 
terreni solidi ed in un terreno liquido che dovrebbe velocizzare la 
crescita dei Micobatteri (vedi [23]). 
3.3.1 Esame colturale in terreno solido 
Il terreno  solido piø utilizzato per soddisfare le esigenze 
metaboliche dei Micobatteri Ł un terreno a base di tuorlo d uovo 
CAPITOLO  3  -  MATERIALI E METODI 
 
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(Lowenstein-Jensen) solidificato con Agar (una soluzione 
nutritiva di base miscelata con tuorlo d uovo, glicerina, fecola di 
patata, sali e  verde malachite che ha potere inibente sulla crescita 
dei lieviti eventualmente sfuggiti al trattamento di 
decontaminazione) e fatto solidificare a  becco di clarino . 
Viene utilizzato anche un particolare tipo di Lowenstein-Jensen 
con aggiunta di PACT, un mix di antibiotici formato da: 
polimixina B, anfotericina B, colistina e trimetoprim, come 
terreno selettivo. Questi farmaci sono in grado di fornire 
copertura nei confronti dei possibili contaminanti (Gram positivi, 
Gram negativi e miceti) sfuggiti al processo di decontaminazione 
e sono privi di attivit  nei confronti dei micobatt eri (vedi [15]). I 
campioni vengono incubati  a 37 C per 42 giorni. 
3.3.2 Esame colturale in terreno liquido 
Nel laboratorio di Microbiologia del Policlinico S. Orsola, il 
sistema di crescita e rilevamento per la diagnosi dei micobatteri Ł 
il BD BACTECTM MGITTM 960 (vedi Figura 3-3). 
 
Figura 3-3: Illustrazione del sistema di crescita e rilevamento per la diagnosi dei micobatteri 
BD BACTECTM MGITTM 960. 
CAPITOLO  3  -  MATERIALI E METODI 
 
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Caratteristica del metabolismo dei Micobatteri Ł l elevato 
consumo di ossigeno e la scarsa produzione di anidride 
carbonica. La tecnologia di BD BACTECTM MGITTM 960, a 
sviluppo di fluorescenza in fase solida con sensore protetto, si 
basa sul consumo di O2, garantendo la massima sensibilit .  
Sul fondo della provetta, all’interno di un film di silicone, Ł 
presente un composto fluorescente (complesso metallico di 
rutenio), sensibile alle variazioni della tensione di ossigeno, che 
funge da sistema rivelatore.  
Reagenti 
• Provetta di terreno (BBL MGIT, Mycobacteria Growth 
Indicator Tube, Becton Dickinson). 
• Arricchimento/ Supplemento di crescita (OADC BBL MGIT, 
Becton Dickinson). 
• Miscela di antibiotici (PANTA BBL MGIT, Becton 
Dickinson). 
Procedimento 
1) Ricostituire un flacone di miscela antibiotica PANTA BBL 
liofilizzata MGIT con 15 ml di supplemento di crescita 
BACTEC MGIT OADC 
2) Svitare il tappo di una provetta MGIT 7 ml, contrassegnata 
con il numero del campione, aggiungere sterilmente 0,8 ml di 
supplemento di crescita/miscela antibiotica PANTA 
ricostituita. 
3) Aggiungere 0,5 ml di campione decontaminato e concentrato. 
4) Riavvitare il tappo delle provette e miscelare con cura. 
5) Inserire le provette MGIT 7 ml nello strumento con 
l apposita icona di  inserimento provetta , previa lettura del 
codice a barre della provetta e del numero di accesso del 
campione. 
 
CAPITOLO  3  -  MATERIALI E METODI 
 
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Le provette saranno automaticamente analizzate dallo 
strumento per tutta la durata del protocollo impostato (42-56 
giorni). Lo strumento esegue una lettura ogni ora, alla quinta 
lettura fa la media e costruisce un punto sulla curva di crescita.  
In presenza di fluorescenza lo strumento segnala la positivit  
del campione. Eseguire l esame microscopico con colorazione di 
Ziehl-Neelsen per verificare se i microorganismi sviluppatisi 
siano micobatteri o batteri contaminanti. 
L importanza del procedimento di identificazione Ł dovuto a 
due aspetti: 
• nelle provette MGIT segnalate come positive dallo strumento 
possono essere presenti piø specie di Micobatteri, dove quelli 
a piø rapida crescita possono essere rilevati prima di quelli a 
piø lenta crescita  
• il test di sensibilit  agli antibiotici deve essere  eseguito solo 
dopo ottenimento di coltura pura di Micobatteri tubercolari; 
solo con questa premessa i risultati successivi 
Figura 3-4: Procedura per l allestimento della coltura liquida mediante sistema MGIT. 
CAPITOLO  3  -  MATERIALI E METODI 
 
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dell antibiogramma (AST) potranno essere considerati 
attendibili. 
Il laboratorio deve quindi confermare, mediante tecniche di 
identificazione appropriate, che la coltura da testare sia 
assolutamente pura, tenendo presente che COLTURE 
CONTAMINATE O CONTENENTI CEPPI MULTIPLI DI 
MICOBATTERI POSSONO DARE RISULTATI AST ERRATI 
(vedi [35] e [36]). 
Nelle colture incubate a 37 C lo sviluppo di MTB  si apprezza 
dopo almeno due settimane. In genere le colonie sono facilmente 
riconoscibili per il loro aspetto  rugoso  e con le ggera 
pigmentazione giallastra (vedi Figura 1-2, Figura 1-3 e [42]). 
3.4 Identificazione mediante biologia 
molecolare 
L  identificazione definitiva della specie micobatterica avviene 
attraverso l impiego di una delle tecnologie molecolari 
attualmente piø diffuse che Ł la  PCR  (Polymerase Chain  
Reaction). 
Il kit commerciale utilizzato presso il laboratorio di 
Microbiologia del Policlinico S. Orsola Ł INNO LiPA 
MYCOBACTERIA v2 (Innogenetics, Ghent, Belgio) e si basa 
sul principio dell ibridazione inversa. Per eseguire il test deve 
essere completata l amplificazione della regione spaziatrice 16S-
23S dell RNA ribosomiale. 
CAPITOLO  3  -  MATERIALI E METODI 
 
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I prodotti di amplificazione biotinilati sono successivamente 
ibridati usando una striscia di tipizzazione per ogni campione 
sulla quale sono fissate 22 sonde parallele di DNA e 2 linee di 
controllo. 
Dopo ibridazione si aggiunge la streptavidina legata a fosfatasi 
alcalina che si lega agli ibridi biotinilati formatisi in precedenza. 
L incubazione con il 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato e con il 
nitroblu di tetrazolio come cromogeno porta alla formazione di 
un precipitato viola/marrone (vedi [24]). 
Figura 3-5: Schema della strip del kit.