Effetti molecolari della Cortical Spreading Depression sulle DNA metiltrasferasi e sullo stato di metilazione del DNA in sistemi modello

Introduzione 
 
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1.2 La metilazione del DNA 
La metilazione del DNA rappresenta un importante meccanismo di regolazione 
epigenetica che si somma alle modifiche istoniche, permettendo una più fine 
regolazione dell’espressione genica cellulare. La modifica coinvolge la posizione 5 
della citosina, presente, soprattutto, nel dinucleotide CpG anche se recentemente è stato 
dimostrato, nelle stem-cells e all’interno dei geni, che la metilazione avviene nell’uomo 
anche in sequenze CHG e CHH (H sta per A, C, T,) comportando in questo caso 
attivazione genica (Pelizzola and Ecker, 2011).  
La metilazione del DNA può avere significati differenti (figura 3). A  livello 
genomico vi sono regioni ad elevata densità del dinucleotide CpG che prendono il nome 
di isole CpG; esse rappresentano regioni di almeno 200bp, il cui contenuto in C+G è 
superiore al 50% e di cui il rapporto in CpG ritrovate rispetto ad attese è superiore a 0,6. 
Solo in rari casi il livello di metilazione di tali isole cambia in funzione dell’espressione 
del gene, poiché sostanzialmente il pattern di metilazione in CpG rimane lo stesso in un 
determinato gene. Le isole CpG sono distribuite lungo l’intero genoma soprattutto nelle 
regioni promotrici dei geni housekeeping e di quelli regolati. La metilazione della 
regione promotrice del gene è associata ad inibizione trascrizionale (Klose and Bird, 
2006). 
 Il significato del processo di metilazione cambia invece a livello di sequenze 
molto ripetute nel genoma (trasposoni), in cui grazie alla metilazione si ha una 
inibizione della mobilizzazione, con conseguente stabilizzazione genomica (Slotkin and 
Martienssen, 2007).
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Figura 2: Rappresentazione schematica della repressione dell’espressione genica 
mediata dal complesso G9a/GLP. Vi è una molecola che lega G9a/GLP alla DNA 
metiltrasferasi 3. Analisi genetiche indicano che la sola G9a o la sola GLP risulta essere 
incapace sia di catalizzare la metilazione in H3K4, sia si reclutare la DNA 
metiltrasferasi, portando alla riattivazione dei geni target.
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I trasposoni rappresentano elementi genetici mobili il cui numero di copie a livello 
genomico è estremamente elevato. In base al loro meccanismo di trasposizione si 
possono distinguere: 1) i trasposoni a DNA (circa l’1% delle sequenze ripetute ed 
intersperse) caratterizzati dalla presenza di estremità ripetute ed invertite ed in grado di 
codificare per l’enzima trasposasi. Il meccanismo di trasposizione di tali sequenze è 
definito di “Cut and Paste”; 2) i retrotrasposoni, o trasposoni ad RNA, necessitano di un 
intermedio ad RNA e codificano per l’enzima trascrittasi inversa. Il meccanismo di 
trasposizione di tali sequenze è detto “Copy and Paste” e accresce notevolmente le 
dimensioni del genoma. I retrotrasposoni (che ammontano a circa il 25% del genoma di 
ratto) possono essere ulteriormente suddivisi in retrotrasposoni L TR (simili a retrovirus 
e caratterizzati dalla presenza di Long Terminal Repeat ) e retrotrasposoni non LTR 
comprendenti le LINEs (Long Interspersed Nucleotide Elements), capaci di trasporre in 
maniera autonoma, e le SINEs (Short Interspersed Nucleotide Elements) che 
necessitano di altri elementi mobili per la trasposizione. Il meccanismo di metilazione 
del DNA nelle germ cells, essenziale per la soppressione della trasposizione, è piuttosto 
chiaro e prevede l’intervento sia delle DNA metiltrasferasi che del complesso PIWI-
piRNA. La proteina PIWI, che appartiene alla famiglia delle proteine Argonauta, lega 
piccoli RNA di lunghezza compresa tra 24 e 32 nucleotidi, detti piRNA, complementari 
alla regioni genomiche codificanti per i trasposoni. È stato proposto che i complessi 
contenenti piRNA guidino le DNA metilasi, dotate di attività de novo, sulle sequenze 
dei trasposoni e, non essendo state evidenziate delle interazioni dirette tra PIWI e 
DNMT3, si ritiene che tale reclutamento avvenga indirettamente (Aravin et al., 2008). 
 È stato dimostrato che la metilazione lungo il corpo del gene è correlata con 
l’attivazione trascrizionale, poiché probabilmente stabilizza l’interazione tra il DNA e la
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RNA polimerasi II durante la fase di inizio della trascrizione, impedendo all’enzima di 
dissociarsi dallo stampo (Aran et al., 2011). Solitamente un gene attivo si presenta in 
forma ipometilata a livello della regione del promotore, poiché si ritiene che la 
metilazione del promotore potrebbe inibire la trascrizione o promuovendo il legame al 
DNA di repressori trascrizionali (tipo MeCP1 e MeCP2) o mascherando sul DNA siti di 
interazione con molecole di attivatori. MeCP2 presenta una regione nota come MBD o 
“methyl-binding domain ”, capace di legare sequenze di DNA metilato; una regione 
responsabile del silenziamento dei geni bersaglio, il dominio di repressione 
trascrizionale (transcriptional repression domain, TRD) e infine, un dominio C-
terminale le cui funzioni non sono ancora ben chiare, ma sembrano essere importanti sia 
per interagire con altre proteine con cui MeCP2 collabora, sia per facilitare il legame al 
DNA. MeCP1 e MeCP2 sono in grado di reclutare deacetilasi e demetilasi istoniche e 
complessi di rimodellamento della cromatina, fungendo da importanti regolatori 
dell’espressione genica nella cellula (Jones et al., 1998). La reazione di metilazione del 
DNA è catalizzata da una classe di enzimi le DNA metiltrasferasi che utilizzano il 
coenzima SAM (S- adenosilmetionina), come donatore di gruppi metili.  
Nei mammiferi sono state ritrovate 5 famiglie di DNA metiltrasferasi: DNMT1, 
DNMT2, DNMT3a e DNMT3b e DNMT3L di cui solo DNMT1 e DNMT3a e 3b 
presentano attività catalitica. In particolare DNMT1 presenta attività di mantenimento 
mentre DNMT3 ha attività de novo. La metilazione di mantenimento consente alle 
cellule figlie di ereditare il pattern di metilazione della cellula madre; quest’ultima 
presenterà infatti entrambi i filamenti di DNA metilati e ciascuno di essi verrà utilizzato 
come stampo ad opera di una metilasi di mantenimento che ristabilirà la metilazione di 
partenza. La metilazione de novo avviene su filamenti di DNA, originatisi da una
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doppia elica non metilata. La DNMT3L non è cataliticamente attiva, ma è in grado di 
reclutare e stimolare l’attività di DNMT3 ed è coinvolta in importanti processi quali la 
gametogenesi e l’Imprinting. L’Imprinting è un fenomeno che avviene nelle cellule 
eucariotiche e dove la metilazione del DNA ha un ruolo preminente. Infatti, nelle cellule 
diploidi, nella maggior parte dei casi, i due alleli sono espressi in uguale misura; ci 
sono, però, alcuni casi dove una copia di un gene è attivamente espressa mentre l’altra è 
silente. Quell’assetto che non viene espresso è soggetto ad una pesante metilazione.  
L’enzima DNMT1, in particolare, nei mammiferi risulta essere indispensabile 
durante le prime fasi dello sviluppo dell’embrione. Il suo ruolo chiave nell’ 
embriogenesi è dimostrato dal fatto che la deplezione dell’enzima in cellule somatiche 
adulte causa disfunzioni cellulari portando alla morte della cellula. La DNMT1 contiene 
un dominio catalico DNA metitrasferasico C-terminale molto conservato che è 
implicato nel mantenimento del pattern di metilazione nel genoma, e un dominio N-
terminale che presenta numerosi domini di legame per il DNA e per altre proteine. La 
presenza di questo ultimo dominio suggerisce una potenziale funzione non catalitica 
dell’enzima. Per esempio, è stato suggerito che la DNMT1 potesse essere implicata, 
tramite l’utilizzo del suo dominio N-terminale, nella regolazione dell’espressione della 
caderina E, una molecola coinvolta nell’adesione delle cellule epiteliali. In particolare, 
la DNA metiltrasferasi interagisce con un complesso repressore che inibisce la 
trascrizione della molecola di adesione cellulare, consentendone così l’espressione 
(Espada, 2012). 
La DNMT1 rappresenta un target per alcune molecole quali gli inibitori della 
DNA metiltrasferasi (DNMT1i) , che possono lavorare in sinergia con gli inibitori di
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istone deacetilasi (HDACi) come potenziali farmaci tumorali. Recentemente è stato 
dimostrato che un inibitore di istone deacetilasi, la tricostatina A, riduce i livelli di 
metilazione globale ed in particolare della DNMT1, sottolineando la cooperazione tra le 
diverse modifiche epigenetiche (Arzenani et al., 2011). DNMT1 e DNMT3b sono 
essenziali per lo sviluppo dell’embrione murino, mentre topi che mancano 
dell’espressione della DNMT3a sopravvivono per molte settimane dopo la nascita. 
Comunque, corretti pattern di metilazione del DNA non sono solo critici per lo sviluppo 
dei mammiferi, ma sono anche richiesti per il controllo della crescita di una cellula 
normale.  
Il ruolo della DNMT3b è stato ben caratterizzato nella sindrome da instabilità 
centromerica, immunodeficienza e dismorfismi (ICF), una malattia rara autosomica 
recessiva, caratterizzata da immunodeficienza, riarrangiamenti caratteristici in 
prossimità dei centromeri (eterocromatina pericentromerica) dei cromosomi 1, 16 e 9 e 
lievi dismorfismi. Recentemente sono stati mostrati in pazienti affetti da questa 
patologia cambi significativi nell’espressione genica di geni critici per la funzione 
immune, lo sviluppo e la neurogenesi, in accordo col fenotipo determinato dalla ICF. I 
geni menzionati vengono iperespressi; sono infatti marcati da bassi livelli di 
metilazione, accompagnati dalla perdita di modifiche istoniche associate a repressione 
come la trimetilazione della lisina 27 nell’istone H3 (H3K27me3) e l’aumento di 
modifiche associate all’attivazione trascrizionale, quali trimetilazione della lisina 4 
dell’istone h3 (H3K4me3) e l’acetilazione della lisina 9 dell’istone H3 (Jin et al., 2007). 
 La DNMT3b è un enzima di largo interesse non solo perché il suo ruolo è molto 
importante durante lo sviluppo, ma anche perché esso è strettamente legato
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all’insorgenza del cancro. La regione N-terminale della DNMT3b contiene un dominio 
PWWP (codificato dagli esoni 6 e 7) ed un dominio PHD (codificato dagli esoni 12 e 
13). Il dominio PWWP è coinvolto nel reclutamento della DNMT3b all’eterocromatina 
pericentromerica e nel suo legame non specifico, mentre il dominio PHD media le 
interazioni proteina-proteina e l’abilità da parte della metiltrasferasi di reprimere la 
trascrizione in maniera dipendente dalle istone deacetilasi (HDAC). La DNMT3b risulta 
overespressa in molti tipi di tumore e la sua deplezione causa l’apoptosi e la 
demetilazione di geni soppressori del tumore ipermetilati nelle cellule cancerose. Quindi 
questa metiltrasferasi contribuisce direttamente alla metilazione aberrante che si verifica 
in cellule tumorali (Gopalakrishnan et al., 2009). 
La DNMT3a è una metiltrasferasi di mammifero de novo. Nell’uomo, essa 
presenta un dominio ammino-terminale che contiene vari siti in grado di reclutare 
repressori trascrizionali. Embrioni che mancano dell’espressione della Dna 
metiltrasferasi 3a mostrano numerosi difetti, tra i quali danni alla crescita e alla 
formazione del tubo neurale. Mutazioni nella DNMT3a sono ricorrenti aberrazioni 
molecolari in pazienti affetti di leucemia mieloide cronica (AML). Il preciso ruolo di 
queste mutazioni nella leucemogenesi rimane ancora elusivo e quello che si sta testando 
è il loro potenziale valore prognostico nei pazienti malati di AML (Schwarz and 
Marková, 2013).  
La metilazione del DNA può essere usata come biomarker per malattie 
cardiovascolari. È stata osservata una globale ipometilazione nelle lesioni 
arteriosclerotiche come conseguenza di una dieta povera di folato o di un’elevata 
concentrazione dell’omocisteina in animali e uomini presi a modello (Kim et al., 2010).
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È stato proposto un ruolo della metilazione intragenica nel regolare promotori 
alternativi. In particolare, si è visto che in alcuni geni per i quali esistono promotori 
alternativi, questi ultimi presentano isole CpG che possono essere metilate. Queste isole 
CpG si trovano in porzioni del gene soggette a modifiche istoniche associate ad 
attivazione trascrizionale, quali la trimetilazione della lisina 4 dell’istone H3. Quindi, si 
è osservato per questi geni una correlazione inversa tra il grado di metilazione del DNA 
e la presenza della modifica H3K4me3 (Maunakea et al., 2010).  
Un’altro ruolo per la metilazione intragenica è stato proposto in un recente lavoro 
sul ratto, ovvero quello di identificare regioni codificanti e quindi di mediare 
nell’evento dello splicing alternativo la scelta degli esoni o l’eventuale ritenzione 
intronica. Difatti, è stata analizzata la metilazione lungo il gene e si è ritrovato che per 
alcuni di essi si ha un pattern di metilazione costante, con geni trascrizionalmente attivi 
che presentano ipometilazione a livello del promotore ed ipermetilazione a livello degli 
esoni. La metilazione nelle regioni non tradotte presenti alle estremità del trascritto 
UTR, invece, risulta essere più accentuata se queste contengono esoni codificanti e 
viceversa. Quindi è stato proposto un ruolo per la metilazione nella scelta degli esoni 
durante lo splicing alternativo o nella ritenzione degli introni (Sati et al., 2012).