Effetti della microgravità sugli osteoblasti: profilo proteomico e metabolomico

2. INTRODUZIONE 
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β. INTRODUZIONE 
 
2.1 IL TESSUTO OSSEO 
 
Il tessuto osseo è il tessuto costitutivo principale dello scheletro, e costituisce 
l’impalcatura interna del corpo, protegge visceri e parti molli oltre a dare inserzione a 
muscoli e tendini. Il tessuto osseo è una forma specializzata di tessuto connettivo, 
caratterizzato dalla mineralizzazione della matrice extracellulare che conferisce al 
tessuto una particolare durezza e resistenza (Adamo, 2006). Nonostante queste 
caratteristiche, l’osso risulta molto leggero e l’associazione resistenza-peso è dovuta 
alla struttura altamente organizzata dell’osso stesso. 
Il continuo rimodellamento dell’osso ha, oltre alla fondamentale funzione meccanica, 
il compito di regolare la concentrazione dei livelli di calcio plasmatico, infatti il tessuto 
osseo rappresenta il principale deposito di ioni calcio per le necessità metaboliche 
dell’intero organismo (Boskey, 1996).  
Il tessuto osseo è costituito da cellule e da una matrice intercellulare, organica ed 
inorganica. La matrice organica è composta da fibre di collagene e da una sostanza 
amorfa, costituita maggiormente da glicoproteine e proteoglicani. Le fibre di collagene 
costituiscono la parte preponderante della componente organica. La matrice inorganica 
è costituita principalmente da fosfato- e carbonato di calcio e rappresenta circa il 65% 
in peso secco dell’osso. 
Possiamo distinguere due tipi di tessuto osseo, l’osso spugnoso e l’osso compatto o 
denso.  
I due tipi di tessuto sono presenti generalmente in tutti i tipi di ossa, con variazioni 
nella distribuzione e nel rapporto tra i due tessuti.  
L’osso spugnoso lo si ritrova principalmente a livello delle ossa brevi, delle ossa piatte 
e delle epifisi delle ossa lunghe: ha questo nome in quanto appare conformato come 
una spugna, con travate ossee, dette trabecole, variamente orientate e intersecate tra 
loro e delimitanti cavità, dette cavità midollari, che in vivo sono ripiene di midollo 
osseo ematopoietico (Canalis et al, 1988). 
L’osso compatto appare invece come solida massa eburnea, privo di cavità 
macroscopicamente evidenti. L’osso compatto lo si ritrova a formare la porzione più
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superficiale delle ossa brevi, delle ossa piatte e delle ossa lunghe, come femore e 
omero, nonché a costituire la diafisi di queste ultime (Adamo et al, 2006).  
 
2.2 LE CELLULE DEL TESSUTO OSSEO 
 
Nelle ossa si distinguono quattro tipi cellulari: cellule osteoprogenitrici (dette anche 
preosteoblasti), osteoblasti, osteociti e osteoclasti.  
Una prima differenza tra questi tipi cellulari sta nel precursore da cui esse derivano. 
Infatti gli osteoclasti derivano dalla cellula staminale ematopoietica e, precisamente, 
sono il risultato della fusione di monociti macrofagi (Fig 1). 
 
 
Figura 1 Tappe del differenziamento degli osteoclasti 
  
La maturazione dei macrofagi in osteoclasti richiede la presenza di osteoblasti o di 
cellule stromali del midollo osseo che secernono il M-CSF (macrophage colony-
stimulating factor) che si va a legare sul recettore c-fms presente sui precursori degli 
osteoclasti. Inoltre è richiesto il contatto tra osteoblasti/cellule stromali e macrofagi, 
attraverso il legame tra il recettore RANK e il suo ligando RANKL, appartenenti alla 
famiglia delTNF (Tumor necrosis factor) e del TNF-R.  
Altra proteina che interviene nell’osteoclastogenesi è la osteoprotegerina (OPG), che 
compete con il recettore RANK.
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Gli osteoclasti sono cellule multinucleate che si riscontrano sulla superficie di 
trabecole ossee in via di riassorbimento, sotto forma di cellule giganti polinucleate dal 
diametro di 20-100 μm (Adamo et al, 2006). Sono spesso accolte nelle cosiddette 
“fossette di Howship”, formatesi proprio grazie all’azione erosiva degli osteoclasti 
(Fig 2). 
 
Figura 2 Osteoclasti e "fossette di Howship" 
 
Sono molto meno basofili degli osteoblasti e sono provvisti di numerosi mitocondri e 
scarso reticolo endoplasmatico. Sono cellule polarizzate la cui superficie presenta un 
caratteristico orletto striato (ruffled border) costituito da prolungamenti citoplasmatici 
tra i quali sono presenti cristalli di apatite, derivati dalla lisi dell’osso, e spesso 
microfibrille di collagene.  
La funzione principale degli osteoclasti è quella di erosione della matrice organica ed 
inorganica, esercitata mediante acidificazione dello spazio extracellulare a livello del 
ruffled border e di secrezione di enzimi idrolitici di origine lisosomiale; infatti è 
presente una ATPasi che aiuta l’acidificazione delle lacune consentendo la 
dissoluzione dei cristalli di idrossiapatite.
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In questa regione proteine ed enzimi come TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase), 
catepsina K e MMP-9 (matrix metalloproteinase-9) sono trasportati nelle fossette di 
Howship, inducendo la degradazione dell’osso (Rinaldo Florencio-Silva et al, 2015).  
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) possono invece differenziarsi, oltre che in 
adipociti e condrociti, in osteoblasti e osteociti (Arfat et al, 2014; Fig. 3). 
 
 
Figura 3 Differenziamento delle cellule staminali mesenchimali (MSC) 
 
L’adipogenesi consta di quattro fasi: blocco della crescita, espansione clonale, 
differenziamento precoce e differenziamento tardivo (Tang and Lane, 2012).  
Le MSC vengono reclutate dallo stroma vascolare del tessuto adiposo fornendo un 
elevato numero di preadipociti, grazie a mediatori chiave che fanno parte delle 
famiglie BMP e Wnt. Dopo questa prima fase di blocco della crescita dei preadipociti, 
essi vengono esposti a fattori che inducono differenziamento, quali IGF-1, 
glucocorticoidi e cAMP, controllando la replicazione del DNA e il rientro nel ciclo
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cellulare (espansione clonale mitotica). Tale espansione clonale induce una cascata di 
segnalazione che porta all’espressione dei geni degli adipociti. Gli eventi chiave di 
questa fase di adipogenesi sono le fosforilazioni del fattore di trascrizione C/EBP 
(CCATT enhancer binding protein ) da parte di una MAPK e di GSKγ.  
C/EBP attivato regola la trascrizione di PPAR ( peroxisome proliferator –activated 
receptor- ) e di C/EBPα, che a loro volta attivano geni responsabili del fenotipo degli 
adipociti.   
Il processo di condrogenesi è invece la prima tappa dello sviluppo scheletrico e 
avviene in più stadi: reclutamento delle cellule mesenchimali (che esprimono 
collagene di tipo I, III e V), migrazione, condensazione dei progenitori (che invece 
presentano collagene di tipo II, IX e XI, specifici della cartilagine), differenziamento 
dei condrociti e maturazione. La condrogenesi termina con la formazione della 
cartilagine (Goldring et al, 2006; M. Goldring, 2012).  
 
2.2.1 DIFFERENZIAMENTO DEGLI OSTEOBLASTI 
 
 
Figura 4 Osteoblasto visualizzato al SEM 
 
Nella formazione dell’osso, le cellule mesenchimali si differenziano in cellule 
osteoprogenitrici che proliferano attivamente e si trasformano in osteoblasti; gli
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osteoblasti, dopo aver deposto la sostanza ossea, si trasformano a loro volta in 
osteociti. Al termine dei processi osteoformativi, nel periostio e nell’endostio 
permangono cellule di origine mesenchimale con potenzialità osteogeniche, le quali 
possono differenziarsi in osteoblasti in risposta ad appropriati stimoli (fratture).  
Le cellule osteoprogenitrici o preosteoblasti sono elementi fusati o leggermente 
appiattiti e non sono distinguibili dai normali fibroblasti. Esse formano uno strato 
continuo, detto strato preosteoblastico, a livello della superficie interna di periostio ed 
endostio. 
I preosteoblasti si riscontrano sulla superficie delle trabecole ossee in via di 
ossificazione e nel tessuto connettivo delle cavità midollari dell’osso.  
Gli osteoblasti partecipano direttamente alla formazione del tessuto osseo secernendo 
i componenti organici della matrice e regolando anche la deposizione dei sali minerali. 
Si riscontrano quindi, in particolar modo, in corrispondenza delle superfici in via di 
espansione delle ossa e nello strato osteogenico di periostio ed endostio durante tutto 
il periodo di morfogenesi dell’osso. Durante la fase di attiva sintesi della sostanza 
ossea gli osteoblasti sono disposti a formare uno strato epitelioide (Adamo et al, 2006).  
Gli osteoblasti sono cellule mononucleate, non completamente differenziate. Quando 
attive, presentano un esteso apparato di Golgi e abbondante reticolo endoplasmatico. 
Inoltre gli osteoblasti formano giunzioni strette (tight junction) con gli osteoblasti 
adiacenti ed hanno regioni di membrana plasmatica specializzate in trasporto 
vescicolare (Caetano-Lopes et al, 2007).  
Anche gli osteoblasti derivano da cellule staminali mesenchimali (MSC) multipotenti, 
indifferenziate con capacità di self-renewal. Il differenziamento, o commitment, delle 
MSC in cellule osteoprogenitrici richiede l’espressione di geni specifici, incluse le 
proteine morfogenetiche dell’osso (BMP), e membri del pathway di segnalazione 
Wnt/ -catenina, oltre all’ormone paratiroideo (PTH) e relativo recettore (Rinaldo 
Florencio-Silva et al, 2015; Hughes et al, 2006).  
Le Wnt sono glicoproteine presenti in tutte le specie animali (Caetano-Lopes et al,  
2007). Il genoma umano codifica per 19 Wnt che, legando recettori sulla superficie 
cellulare, mediano una cascata di eventi che regolano diverse attività cellulari.  
Le Wnt attivano tre distinte cascate di segnalazione intracellulare, tra cui il pathway 
Wnt/ -catenina, che solitamente regola il destino cellulare, la proliferazione e la
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sopravvivenza incrementando i livelli di -catenina. L’attivazione di questa via di 
segnalazione avviene in seguito al legame di Wnt a Frizzled, recettore transmembrana 
associato al corecettore LRP5/6 (Low-density lipoprotein receptor related protein 
5/6). In assenza del ligando Wnt, i livelli citosolici di -catenina sono mantenuti bassi 
grazie alla sua fosforilazione e degradazione e sono spenti i geni attivati da Wnt. Il 
ruolo fondamentale della segnalazione Wnt nella formazione ossea emerge da studi 
effettuati inattivando il corecettore LRP5, inducendo l’osteoporosi. Inoltre, mutazioni 
a guadagno di funzione di questo recettore aumentano la segnalazione Wnt e 
l’attivazione degli osteoblasti, che sembrano così essere “protetti” dall’apoptosi.  
LRP5 interagisce con proteine della famiglia Wnt formando un complesso con 
Frizzled, attivando il pathway di segnalazione Wnt.  
L’attività della -catenina è essenziale per il differenziamento degli osteoblasti maturi 
e quindi per la formazione ossea, anche se la sua assenza non interferisce con il 
differenziamento delle cellule osteoprogenitrici in precursori precoci osteoblastici, 
piuttosto va a bloccare l’espressione di Osx (Osterix) e di conseguenza queste cellule 
progenitrici si differenzieranno in condrociti. 
L’effetto di LRP5 sulla massa ossea mediato da -catenina riguarda l’espressione di 
un marker osteoblastico, la fosfatasi alcalina (ALP).  
L’espressione di Wnt10b induce l’espressione di Cbfa1, di Dlx-5 e di Osx, stimolando 
l’osteoblastogenesi, mentre inibisce il fattore C/EBPα e PPAR, bloccando 
l’adipogenesi. Quindi Wnt ha un ruolo anche nel commitment delle MSC e 
nell’adipogenesi, sottolineando che un aumento del differenziamento degli osteoblasti 
è associato ad un decremento di quello degli adipociti. 
Tra le BMPs, la BMP2, 4 e 7 hanno un ruolo cruciale nel differenziamento degli 
osteoblasti (Rinaldo Florencio-Silva et al, 2015). Il microambiente, in particolare gli 
stress meccanici, influiscono sull’espressione di BMPβ, che in condizioni fisiologiche 
costituisce il fattore osteogenetico principale in quanto promuove il differenziamento 
degli osteoblasti aumentando l’espressione delle proteine della matrice (Dai et al, 
2013). BMP2 attiva R-Smad e cascate di segnalazione chinasi dipendenti, quali 
PI3K/Akt e MAPK. Tra i target di queste proteine troviamo Runx2 (Runt-related 
transcription factors 2, detto anche Cbfa1), Osx (Osterix) e TAZ.