Due metodi innovativi per correggere la trisomia 21: silenziamento mediato da XIST e rimozione del cromosoma extra

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RIASSUNTO 
Il genoma umano è normalmente composto da 22 coppie di cromosomi omologhi ed 
una coppia di cromosomi sessuali (XX nelle cellule femminili e XY nelle cellule 
maschili). In seguito a mutazioni, però, il cariotipo (patrimonio cromosomico) può 
modificarsi nel numero o nella morfologia dei cromosomi che lo costituiscono, dando 
così origine, rispettivamente, alle anomalie numeriche (aneuploidie) o strutturali dei 
cromosomi. Le an e uploi die   più   fr e que nti   ne ll ’uomo   sono   le   trisom ie   (pr e se nz a   di   un   elemento addizionale in una coppia di cromosomi omologhi), che possono alterare i 
fenotipi cellulari e produrre anomalie congenite. Tra le trisomie compatibili con la 
vita, la più frequente è la trisomia, completa o parziale, del cromosoma 21 (Hsa21), 
che è la causa, nel 95% dei casi, della sindrome di Down, riscontrata in circa un 
bambino su 800. Numerosi sono i problemi clinici causati da questa sindrome, ad 
esempio: diverse caratteristiche fenotipiche tra le quali alterazioni nella morfologia 
facciale e bassa statura; ritardo mentale; anomalie a livello dei sistemi cardiovascolare 
e gastrointestinale; alto rischio di leucemia ed insorgenza precoce del morbo di 
Alzheimer.  
Per determinare gli effetti della copia extra del cromosoma 21 sono stati svolti 
differenti studi comparando cellule disomiche e cellule trisomiche derivanti da 
individui distinti. I risultati di simili analisi sono però altamente influenzati da 
differenze genetiche ed epigenetiche tra le cellule comparate, che non permettono di 
attribuire con certezza un effetto fenotipico al cromosoma in sovrannumero. Per 
ovviare a questo problema sarebbe necessario comparare cellule geneticamente 
uguali, a meno del numero di copie del cromosoma 21. Creare cellule disomiche e 
trisom iche   isogenic he   e c c e tt o   una   c opia   de l   c rom osom a   21   è   l’obie tt ivo   d e i   due   studi   esaminati in questa tesi. 
Russel e colleghi hanno derivato cellule disomiche, da una linea cellulare trisomica, 
inducendo la perdita di una delle tre copie del cromosoma 21. Per ottenere queste due 
linee isogeniche, gli autori hanno generato cellule staminali pluripotenti indotte 
trisomiche a partire da fibroblasti di un individuo affetto da sindrome di Down ed 
hanno integrato, nel locus APP di una copia del cromosoma 21, il transgene di fusione 
TKN EO.   I l   p rodotto   de l   ge ne   NE O   c onf e risc e   a ll e   c e ll ule   re sis tenz a   a ll ’a nti biot ico  
g e n e ti c ina,   us a to   c om e   mar c a tore   di   se lez ion e   pe r   l’ a c quisi z ione   de l   tra ns g e ne ,  
mentre il gene TK codifica per la timidina chinasi, che rende le cellule sensibili al 
ganciclovir. Tra le cellule trasformate, selezionate positivamente in quanto resistenti 
alla geneticina e poi coltivate per un certo tempo in assenza di geneticina per rendere 
superfluo il gene di fusione TKNEO, gli autori hanno sfruttato la sensibilità al 
ganciclovir per selezionare negativamente le cellule ancora possedenti il gene TK ed 
isolare solo quelle diventate GCV resistenti. La causa più comune di sopravvivenza al 
Ganciclovir è risultata la perdita spontanea del l’int e ro cromosoma 21 contenente il 
transgene TKNEO, che generava quindi una linea disomica. Ottenuta la linea 
disomica, gli autori hanno svolto diverse analisi per confrontare questa e la linea 
parentale trisomica: hanno confermato, tramite analisi dei profili di espressione genica 
globale, la sovraespressione dei geni sul cromosoma 21 nelle cellule trisomiche 
rispetto alle disomiche ed hanno poi analizzato la proliferazione cellulare osservando 
che le cellule disomiche proliferavano più velocemente rispetto alle trisomiche. 
Hanno svolto analisi anche sul differenziamento cellulare notando che, seppur in vitro 
il differenziamento in direzione ematopoietica non era considerevolmente diverso tra 
le due linee, in vivo la linea disomica produceva più cellule endoteliali rispetto alla 
linea parentale trisomica. Tramite questo metodo di rimozione mirata di una trisomia 
gli autori hanno potuto determinare alcune caratteristiche delle cellule trisomiche
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realmente dovute alla terza copia del cromosoma 21, come: over-espressione dei geni 
sul cromosoma 21, lenta proliferazione cellulare e difetto nel differenziamento 
endoteliale. 
Lawrence e colleghi hanno invece generato cellule trisomiche in cui una copia del 
cromosoma 21 poteva essere silenziata e solo due copie del cromosoma 21 
rimanevano funzionanti. Per ottenere il silenziamento della copia extra, gli autori 
hanno inserito in una copia del cromosoma 21 un costrutto contente il gene XIST 
sotto il controllo di un promotore indotto da doxiciclina. Il ge ne   X I S T   pr od uc e   l’RNA  
non codificante responsabile del normale silenziamento di una copia del cromosoma 
X   ne ll e   c e ll ule   fe m mi nil i.   Dopo   l’i nse rz i one ,   tra mi te   l’inn ovativa tecnica 
de ll ’ing e g n e riz z a z ione   d e l   g e noma   uti li z z a ndo   n uc lea si   z inc   fing e r,   e   l’in duzione del 
transgene in cellule staminali pluripotenti indotte derivanti da un individuo maschio 
affetto da sindrome di Down, gli autori hanno potuto notare che il cromosoma 21 
contenente il transgene veniva sottoposto alle stesse modificazioni che normalmente 
a vve n g ono   sul   c romosoma   X   sil e nz iato,   c ome   l’ a c c umul o   di   pa rticola ri   modi fic a z ioni   istoniche e la condensazione del cromosoma a corpo di Barr, modifiche che rendono 
la cromatina non più accessibile al macchinario di trascrizione. Hanno verificato il 
silenziamento trascrizionale di alcuni particolari geni sul cromosoma 21 
ingegnerizzato e, tramite analisi del profilo genomico totale, hanno constatato che 
XIST riportava il livello di espressione del cromosoma 21 ad un valore simile a quello 
di cellule disomiche. Le cellule con un cromosoma X silenziato hanno mostrato una 
maggior velocità di proliferazione rispetto alla linea parentale trisomica, e sono 
risultate anche più efficienti nel differenziamento neuronale. Gli autori hanno poi 
appurato che, una volta silenziato il cromosoma, questo rimaneva funzionalmente 
inatti vo   a nc he   dopo   rimoz ione   de ll ’induz ione   di   X I S T.   C ome   ult im o   e sper im e nto,   hanno inserito il transgene in fibroblasti femminili non immortalizzati, osservando 
che il silenziamento era efficiente anche in questa linea cellulare differenziata.  
I due studi hanno quindi proposto due metodi diversi, entrambi risultati efficienti, per 
correggere in vitro la trisomia 21: Russel e colleghi hanno descritto un metodo per 
rimuovere in modo mirato il cromosoma extra, mentre il sistema creato da Lawrence 
e   c oll e g hi   for nisc e   un   m e todo   inducibil e   pe r   indu rne   il   sil e nz iame nto.   L ’ a ppli c a z ione   im media ta   di   que sti   due   sis temi   è   ne ll ’a mbi to   de l la   ric e rc a :   possono   e sser e   uti li z z a t i   per ottenere maggiori informazioni sulla patogenesi della sindrome di Down 
confrontando cellule trisomiche e disomiche derivanti da una stessa linea parentale. 
D’ a lt ro   c a nto   potre bb e ro   a nc he   e sse re   vist i   c om e   un   pr im o   pa sso   v e rso   u na   ter a pia  
cromosomica. Una prima applicazione clinica potrebbe essere quella di creare in
vitro, da cellule prelevate da un paziente affetto da sindrome di Down, cellule 
geneticamente o funzionalmente disomiche, che possano essere ritrapiantate quando il 
paziente ne abbia bisogno. Questo processo potrebbe aiutare, fornendo al paziente le 
sue stesse cellule ma mancanti degli effetti negativi dovuti alla presenza della terza 
copia del cromosoma 21, nel trattamento di sintomi quali la predisposizione alla 
leuc e mi a  e  l’insor ge nz a   pr e c oc e  de l  m or bo  di  Alz he im e r.
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INTRODUZIONE 
LA CROMATINA 
Negli eucarioti, il DNA è organizzato nel nucleo in complessi di DNA e proteine noti 
come 'cromatina'. L'unità di base della cromatina è il nucleosoma, costituito da 146 
paia di basi (bp) di DNA che si avvolgono per circa due volte intorno a un ottamero di 
piccole proteine altamente basiche, gli istoni. L ’otta m e ro   è   c osti tui to   da   ist oni   d i   diverso tipo: due H2A, due H2B, un H3 e un H4. I nucleosomi sono separati tra loro 
da 10-100 bp di DNA linker (di connessione). Questo è il primo livello di 
organizzazione della cromatina ed è chiamato 'collana di perle'. I nucleosomi 
interagiscono tra di loro avvolgendo la cromatina a formare il livello superiore di 
or ga niz z a z ione:   la   “ fibr a   da   3 0   nm”.   L a   c roma ti na   si   compatta ancora di più, formando delle anse e 
costituendo una fibra da 100-400 nm di spessore. 
Questa struttura è quella tipica dei cromosomi in 
interfase, i quali si condensano ulteriormente per 
raggiungere la compattezza dei cromosomi metafasici 
(Figura 1). 
Si distinguono due tipi di cromatina, differenti in 
strutt ur a   e   funz ione:   l’e u c roma ti na   è   tr a sc riz ional mente   attiva o potenzialmente attiva, il DNA è meno 
compatto ed accessibile al macchinario di trascrizione; 
l’e ter oc roma ti na   è   tra sc riz ionalmente   iner te , più 
compatta e non accessibile. Le due strutture 
differiscono nelle specifiche modificazioni presenti 
sugli istoni di cui sono composte, tra le quali, 
acetilazione, metilazione e ubiquitinazione. Solitamente, istoni acetilati e poco 
metilati caratterizzano l’ e uc roma ti na ,   mentr e   l’e t e roc rom a ti na   ha   ist oni   p oc o   a c e ti lati  
e ipermetilati.  
COMPENSAZIONE DEL DOSAGGIO DEI GENI SUL CROMOSOMA X 
I genomi di cellule femminili e cellule maschili differiscono per quanto riguarda i 
cromosomi sessuali. Nei mammiferi le cellule femminili possiedono due cromosomi 
X, mentre le maschili un cromosoma X e un cromosoma Y. Il cromosoma X è grande 
e contiene più di 1000 geni, mentre il cromosoma Y è più piccolo e ne contiene meno 
di 100 (Figura 2). Se la femmina esprimesse nello stesso 
modo i geni presenti su entrambe le copie del cromosoma 
X, le sue cellule avrebbero il doppio di questi prodotti 
proteici rispetto al maschio. I mammiferi hanno sviluppato 
un meccanismo di compensazione del dosaggio che, 
permettendo la funzionalità di un solo X in ogni cellula, 
rende uguale il livello di espressione dei geni associati 
a ll ’X   ne i   due   se ssi . Tale compensazione si ottiene mediante 
inattivazione trascrizionale di uno dei due cromosomi X 
nelle cellule somatiche femminili diploidi, processo noto 
c ome   inatti va z ione   de ll ’X . Questo processo avviene in uno 
stadio precoce dello sviluppo embrionale, quando il 
cromosoma X da inattivare viene scelto a caso tra quello di 
derivazione materna e quello di derivazione paterna, 
secondo un processo indipendente da cellula a cellula. Di 
conseguenza alcune cellule inattiveranno il cromosoma X 
Figura 1. Livelli di 
organizzazione della 
cromatina. 
Figura 2. Ideogramma 
del cromosoma X e del 
cromosoma Y
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paterno e altre quello materno (B. Alberts, 2009; A. Surani, 2011). L'inattivazione ha 
inizio da una regione situata nella porzione q13 del cromosoma X, chiamata Xic 
(centro di controllo dell'inattivazione) per poi diffondersi lungo il 
cromosoma. All’int e rno   di   Xic   si   tro va un gene il cui prodotto è un lungo RNA non 
codificante (17- 19   kb),   il   g e ne   X I S T   ( B .   Mi g e on,   2013) .   L ’RN A   X I S T   c opre   il   cromosoma dal quale è trascritto, diffondendosi dal sito di sintesi in entrambe le 
direzioni (Figura 3). Immediatamente dopo che il cr omos oma   viene   c ope r to   da ll ’RNA   XIST, questo richiama il complesso proteico Polycomb che dà inizio ad una cascata 
di eventi che inducono il processo di eterocromatizzazione: la cromatina del 
cromosoma X passa da eucromatina ad eterocromatina. Avviene quindi un 
rimodellamento della cromatina che comporta diverse modificazioni: per prima cosa 
a vviene   l’ipoa c e ti laz ione   de g li   ist oni   H3   e   H4;;   i n   se g uit o,   mentr e   X I S T   si   diff onde ,  
l’ist one   H3   viene   metil a to   sul   re siduo   di   li sina   9   (H 3K9) ,   dim e ti lato   sul   re siduo   di  
li sina   4   (H 3K4)   e   trime ti lato   sul   re siduo   di   l isi na   27   (H 3K27)   mentr e   l’ist one   H4  
viene metilato sul residuo di lisina 20 (H4K20); successivamente viene incorporata 
sul cromosoma la variante istonica macroH2A1 poi ubiquitinata sul residuo di lisina 
119 (H2 AK 119);;   l’ulti mo   pa ssa gg io   è   la   metil a z ione   de l   DN A   a   li ve ll o   de i   pr omot or i.   La metilazione del DNA avviene solo dopo che sono avvenute le modificazioni 
istoniche sopra elencate, quindi solo sulla copia del cromosoma X con una struttura 
cromatinica non più competente alla trascrizione. In ultima analisi, è il 
rimodellamento della cromatina che rende il cromosoma silenziato. A questo punto 
l’inatti va z ione   è   stabil e   e   X I S T   non   è   più   ne c e ssar io   pe r   mante ne r e   lo   stato   sil e nte   de l  
cromosoma: le modificazioni sono in grado di autopropagarsi e lo stato di metilazione 
del DNA viene accuratamente replicato durante la mitosi, permettendo una fedele 
trasmissione dello stato della cromatina dalla cellula madre alle figlie (B. Lewin, 
2012; K. Plath, 2002; A. Wutz, 2007). 
Il cromosoma eterocromatico X inattivo può essere 
visualizzato al microscopio come un corpo di Barr, 
nome dato al cromosoma X condensato, situato 
vicino alla membrana nucleare. Il corpo di Barr ha 
una forma non lineare, con i due telomeri che si 
avvicina no   l’un   l’a lt ro,   c osa   c he   può   spiega re   la  
forma curvata che si osserva. 
È importante che in ogni cellula un cromosoma X 
riman ga   a tt ivo.   Tuttavi a   a ll ’iniz io   de ll o   svi lu ppo   e mbriona le   l’e spr e ssi one   di   X I S T   è   a tt iva   su   tut te   le  
copie del cromosoma X; se non avvenisse qualcosa 
per reprimere XIST su uno di essi, tutte le copie 
verrebbero silenziate (sia in cellule femminili che in 
cellule maschili), portando ad una nullisomia letale. 
La regione XIC su di un cromosoma deve quindi
ricevere un segnale che reprima il gene XIST su quel cromosoma, destinato così a 
rimanere attivo. Mentre l’inatti va z ione   de l   c romosoma   X   da   pa rte   di   X I S T   è   un  
evento in cis, in questo caso intervengono fattori in trans codificati da geni presenti su 
autosomi, che funzionano da regolatori negativi per il gene XIST. Indipendentemente 
dal numero di copie in cui è presente il cromosoma X, solo uno rimane attivo in ogni 
cellula diploide. Presumibilmente, quindi, in cellule diploidi questi fattori sono 
presenti in una quantità sufficiente per spegnere solo un allele XIST. Una volta che 
queste proteine regolatrici hanno legato recettori presenti nel locus XIC di un 
Figura 3. Schema del 
silenziamento mediato da XIST
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c romosoma   X,   non   pos sono   lega rsi   a nc he   a ll ’ a lt ro   c romosoma,   sul   q ua le   X I S T  
rimarrà quindi funzionante.  
All’ini z io   de ll o   svil upp o   e mbriona le,   X I S T   è   e spre sso   d a   tut te   le   c opie   de l   cromosoma X, ma ad un livello troppo basso per indurre il silenziamento. Ad un certo 
punto dello sviluppo, XIST viene represso su di un cromosoma e over-espresso sugli 
altri. Il primo passaggio nella compensazione del dosaggio è la scelta casuale di quale 
X debba rimanere attivo, e la   pr otez ione   de l   c ro moso ma   sc e lt o   da ll ’ina tt ivaz ione   da   pa rte   di   X I S T.   I l   se c ond o   pa ssagg io   è   l’inatti va z ione   di   tut t i   g li   a lt ri:   da   t utt i   g li   a lt r i   cromosomi X, XIST continua ad essere espresso ad alto livello, le molecole di RNA 
di XIST si accumulano (coating) sul cromosoma stesso e richiamano i fattori in trans 
necessari per modificare la cromatina. Una volta silenziato, il cromosoma X inattivo 
rimane silente nella cellula e nella sua progenie, quindi il pattern di inattivazione è 
clonalmente ereditato. 
Il 10% circa dei geni presenti sul cromosoma X inattivato mantengono una certa 
a tt ivi tà   tra sc riz ionale ,   o vve ro   “ sfu gg ono”   a ll ’in a tt ivaz ione   in   c is   de ll ’ X.   L ’a tt ivi tà  
trascrizionale del cromosoma X inattivo è confinata soprattutto nelle regioni 
pse udoa utoso mi a li   (r e g i oni   de ll ’X   e   de ll ’Y   c he   a ssom i g li a no   a i   c romosomi   autosomici perché contengono geni XY omologhi che sono liberamente scambiati 
durante la meiosi). 
E’  uti le  spe c ifica re  c he  la  c a p a c it à  di  X I S T  di  le g a re  la  r e g ione  d a l  quale  è   sint e ti z z ato 
non dipende dalla sua posizione nel genoma. Infatti, se la regione di XIC viene 
inserita come transgene in un autosoma, questo è soggetto ad inattivazione. Questa 
capacità di legame è infatti intrinseca in XIST e ciò gli permette di iniziare il 
silenziamento (pathway, appunto, di default) di qualsiasi cromosoma dal quale è 
a de g ua tam e nte   tra s c ritto;;   l’unic a   ne c e ssi tà   è   c h e   ve n g a   e spre sso   a d   a lt i   li ve ll i   (B .  
Migeon, 2013).  
LE ANEUPLOIDIE 
In seguito a mutazioni il cariotipo può modificarsi nel numero o nella morfologia dei 
cromosomi che lo costituiscono, dando così origine rispettivamente alle anomalie 
numeriche (aneuploidie) e strutturali dei cromosomi. Tra le aneuploidie, la più 
frequente è la trisomia (presenza di un elemento addizionale in una coppia di 
cromosomi omologhi). L'aneuploidia è causata, nella maggior parte dei casi, da errori 
di non-disgiunzione alla meiosi, che causano la formazione di gameti contenenti un 
numero errato di cromosomi. Nel caso di una trisomia, s e   l’e r ror e   a vviene   a ll a   meio si 
I, due gameti saranno di 24 cromosomi e conterranno sia la componente materna che 
la componente paterna di una coppia, gli altri due gameti ne avranno 22; se avviene 
durante la meiosi II, un gamete avrà 24 cromosomi (uno sarà di 22 e gli altri due di 
23) e conterrà entrambe le coppie del cromosoma materno o paterno (R. Nussbaum et
al., 2005). 
LA SINDROME DI DOWN 
Tra le trisomie compatibili con la vita, la più frequente è la trisomia, completa o 
parziale, del cromosoma 21 (Hsa21), che è la causa, nel 95% dei casi, della sindrome 
di Down, riscontrata in circa un bambino su 800. La trisomia del cromosoma 21 
deriva, generalmente, da una non-disgiunzione meiotica durante la meiosi materna 
(90% dei casi) (la probabilità che avvenga una non-disgiunzione aument a   c on   l’ e tà  
della donna), soprattutto alla meiosi I, ma può verificarsi anche nella meiosi paterna 
(5% dei casi), principalmente alla meiosi II. Nel 5% dei casi avviene non-
disgiunzione mitotica post-zigotica, in uno zigote normale al momento del