Differenze legate al sesso nelle risposte comportamentali del pesce zebra (Danio rerio) indotte sperimentalmente da stimoli ambientali, sociali e artificiali

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Riassunto 
 
Lo Zebrafish (Danio rerio, Cyprinidae) è un organismo modello, a livello 
sperimentale, che trova applicazioni in diverse discipline e tematiche, compresi gli studi 
su svariate malattie dell’Uomo. 
Questa specie è caratterizzata da un complesso etogramma di comportamenti 
sociali; le interazioni intraspecifiche coinvolgono diversi canali comunicativi, come 
quello visivo e quello chimico. Nonostante i numerosi studi presenti in letteratura, 
ancora non è stato chiarito su che basi lo Zebrafish manifesti la sua preferenza sociale, 
in particolare per lo shoaling e la mate choice, se ci sia un’eventuale influenza 
dell’ambiente su tale preferenza e come questa possa variare tra individui di sesso 
maschile o femminile.  
Nel presente studio si sono volute testare le risposte comportamentali del Danio 
rerio, a seguito di stimoli sociali e non. Sono stati eseguiti due diversi esperimenti, 
utilizzando 20 individui (maschi, n = 10; femmine, n = 10) per ciascuno, per un totale 
di 40 animali: il primo riguardava la scelta sociale influenzata da un determinato colore 
dell’habitat (i gruppi, uno per i maschi e uno per le femmine, sono stati tenuti isolati per 
7 giorni e ciascuno è stato posto in un ambiente con un determinato colore ambientale), 
mentre nel secondo sono state osservate le risposte comportamentali a stimoli sociali in 
2D (immagini modificate tramite software di elaborazione grafica).  Per entrambi gli 
esperimenti si è voluta studiare la scelta tra due stimoli, diversi per ogni test 
comportamentale, focalizzandosi solo sulla discriminazione visiva. Come ambiente 
sperimentale per i test comportamentali è stato utilizzato un multi-purpose cross-maze e 
tutti i movimenti di ciascun individuo focale sono stati registrati e misurati utilizzando 
un software di video-tracking, Ethovision XT 11.5. 
Nel primo esperimento è emersa l’idea che non esista una netta influenza della 
colorazione ambientale sulle scelte sociali, sia per i maschi che per le femmine. Vi sono 
state invece alcune differenze significative tra maschi e femmine nell’ambito sociale: i 
primi hanno passato più tempo vicino ad altri maschi, senza mostrare preferenze tra un 
singolo individuo rispetto ad uno stimolo formato da 3 individui; le seconde invece 
hanno passato meno tempo vicino ad altri individui dello stesso sesso e hanno preferito 
un singolo maschio rispetto a 3 maschi.  
Nel secondo esperimento si è visto come sia i maschi che le femmine abbiano
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mostrato più volte una preferenza per immagini rappresentanti femmine con grossa 
taglia e con una regione addominale ingigantita, preferendo entrambi 3 individui ad uno 
singolo ma le femmine hanno preferito, in questo caso, un individuo di sesso femminile 
rispetto ad uno della stessa taglia ma di sesso maschile. Sempre le femmine, hanno 
mostrato una preferenza per l’immagine di un individuo di sesso femminile con 
colorazione blu rispetto ad una di colore verde o rosso e per l’immagine di un maschio 
di grossa taglia rispetto ad uno di piccola taglia. Differentemente, i maschi hanno 
invece mostrato una preferenza per l’immagine di 1 femmina grande rispetto a quella di 
3 femmine piccole. 
In generale, le risultanze di questo studio mostrano come gli individui di entrambi 
i sessi siano in grado di discriminare uno stimolo sociale rispetto ad un altro solo con il 
contatto visivo, ma che le femmine siano più selettive rispetto ai maschi. I risultati del 
primo esperimento sono in linea con l’ipotesi evidenziata da alcuni autori di come le 
femmine di Zebrafish tendano ad evitare altri individui dello stesso sesso. Infatti, 
esistono alcune evidenze sperimentali che mostrano come in un gruppo formato da sole 
femmine si vengano a stabilire forti gerarchie sociali, con conseguenti alti livelli di 
aggressività inter-individuale, e ciò, durante un successivo test sull’efficienza di 
accoppiamento, sembrerebbe influire negativamente sulla fitness dei singoli individui.  
Dal secondo esperimento invece l’idea che emerge è che gli individui di entrambi 
i sessi, ma in particolar modo le femmine (nonostante queste tendono ad evitarsi se 
hanno la possibilità di scegliere) preferiscono fare shoaling con individui più grandi e 
quindi potenzialmente più in salute, indipendentemente dal sesso. Non sembra chiaro, 
almeno per il momento, se la presenza di una regione addominale particolarmente 
ingrandita possa anche essere, in quanto indicatore di fertilità, un fattore determinante 
nella scelta del partner da parte dei maschi.  
Dal momento che una più ampia comprensione dell’etologia sociale e sessuale 
delle specie ittiche potrebbe portare ad utilizzare l’alterazione dei comportamenti di 
shoaling e mate choice come indicatore dell’impatto di particolari problemi ecologici 
(tra cui inquinamento, distruzione dell’habitat, presenza di specie invasive e 
innalzamento globale della temperatura delle acque), tale metodologia potrebbe trovare 
numerose applicazioni per studi futuri, con Danio rerio e non solo.
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1. INTRODUZIONE 
 
1.1. Chi è Zebrafish? 
 
1.1.1. Informazioni generali e caratteristiche fisiche 
 
Il “Pesce zebra”, Danio rerio (Hamilton, 1822), conosciuto anche come danio 
zebrato o Zebrafish, è una piccola specie tropicale d’acqua dolce appartenente alla 
famiglia dei Ciprinidi (Cyprinidae). 
In letteratura scientifica spesso si riporta la denominazione più formale, ma del 
tutto equivalente, Brachydanio rerio: dal Greco Antico si ha “βραχύς” (brakhús), che 
letteralmente significa “corto”, insieme al termine “dhani”, che in lingua Bengalese sta 
ad indicare tutte quelle specie con una forma minnow-like che vivono nelle risaie. Il 
termine rerio, invece, sembra che derivi dal nome comune con cui questa specie viene 
chiamata dalle popolazioni indigene di alcuni Paesi Asiatici (Seriouslyfish.com). 
L’attributo “zebrato” è dovuto alla presenza di strisce longitudinali, di colore 
chiaro e scuro, lungo i due lati del corpo, oltre che sulla pinna anale e caudale 
(Schilling, 2002). 
Per quanto riguarda l’attività, lo Zebrafish mostra un robusto pattern circadiano, 
con uno stato attivo durante le ore diurne e uno stato di riposo, simile al sonno dei 
Mammiferi, durante la notte (Zhdanova, 2005). 
Lo Zebrafish difficilmente supera i 40 mm di lunghezza (dalla punta della parte 
rostrale fino all’origine della pinna caudale), con un corpo fusiforme e compresso 
lateralmente. Come gli altri minnow, presenta una sola pinna dorsale e sono sprovvisti 
di pinna adiposa; la testa è corta (occupa solo il 10-15% della lunghezza totale), gli 
occhi sono centrali e la bocca è inclinata (Spence et al., 2008). 
L’elemento diagnostico di questa specie è, come detto, la presenza di 
caratteristiche linee longitudinali con colorazione alternata: sono particolari pigmenti 
cellulari a determinare tale colorazione. Nell’individuo adulto vi sono cinque strisce di 
colore blu-nero (con melanofori e iridofori) alternate a cinque strisce di colore giallo-
argento (con xantofori e iridofori) [Fig.1]. La colorazione è la stessa per entrambi i sessi 
ma, generalmente, i maschi mostrano una colorazione più scura rispetto alle femmine
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(Schilling, 2002). Come per molti altri Teleostei, i melanofori possono essere dispersi o 
aggregati, per scopo comunicativo (ad esempio per comportamenti aggressivi e di 
freezing, Gerlai, 2003) oppure in risposta alla variazione di luminosità (Guo, 2004). 
La pinna dorsale e la coppia di pinne anali sono collocate posteriormente, garantendo 
un nuoto rapido e performante che caratterizza questa specie (Schilling, 2002). 
 
 
Fig.1 Zebrafish, Danio rerio (Noldus.com) 
 
1.1.2. Distribuzione geografica ed ecologia 
 
La reale distribuzione geografica del Danio rerio non è stata ancora totalmente 
determinata (Arunachalam et al., 2013). Tradizionalmente, si considera che il range 
geografico di questa specie si estenda dal Nepal allo Stato Indiano di Karnataka, da 
Nord a Sud, mentre dal Pakistan a Myanmar (Birmania), da Ovest a Est [Fig.2]. Ma i 
dati ad oggi utilizzati non sono aggiornati e potrebbero essere, in alcuni casi, anche 
molto imprecisi: molte specie morfologicamente “Zebrafish-like” sono state scoperte 
solo recentemente e queste potrebbero aver portato alla sovrastima del Danio rerio in 
alcune regioni (Engeszer et al., 2007). 
Ne è stata documentata la presenza anche in alcuni flussi d’acqua dolce della 
Colombia (Welcomme, 1988) e degli Stati Uniti (Whitworth, 1996): in questo caso la 
distribuzione del Danio rerio, in quanto specie alloctona e potenzialmente invasiva, 
sembra dovuta a rilascio e / o fuga da allevamenti ittici.
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Dato che la distribuzione geografica dello Zebrafish si estende per buona parte 
del subcontinente Indiano, questa specie è in grado di resistere ad un ampio range di 
temperatura, dovendo far fronte ad un tipico clima monsonico caratterizzato da forti 
oscillazioni stagionali che vanno dai 6 °C durante l’inverno fino ai 38 °C durante 
l’estate (Spence et al., 2008). 
 
 
Fig.2 Approssimativa distribuzione geografica del Danio rerio in natura. Nell’immagine sono indicati i 
siti, dai più antichi ai più recenti, di documentata presenza della specie (Parichy, 2015). 
 
In natura il danio zebrato si trova maggiormente in acque ferme e stagnanti, come 
laghi, pozze, stagni, risaie, fossati e piccoli corsi d’acqua; nelle aree in cui è presente 
tende ad essere molto abbondante (Spence et al., 2006; Delaney et al., 2002).  
L’alta concentrazione di fertilizzanti all’interno delle coltivazioni di riso 
promuove la crescita dello zooplankton, uno dei principali componenti della dieta del 
Danio rerio, motivando la presenza della specie in questi siti (Spence et al., 2008). 
L’impatto dell’Uomo, con costruzione di canali artificiali ed ingenti impianti di 
irrigazione, per lo meno per quel che riguarda le risaie, non sembra influenzare la 
sopravvivenza e la riproduzione dello Zebrafish (Engeszer et al., 2007).
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In generale, è facile trovare questa specie in corpi d’acqua stagionali, poco 
profondi (approssimativamente non superiori ai 30 cm), ricchi di vegetazione acquatica 
e con substrati limosi. Osservazioni comportamentali sulla distribuzione verticale hanno 
mostrato che gli Zebrafish occupano l’intera colonna d’acqua, senza particolari 
preferenze (Spence et al., 2008).  
Gli Zebrafish sono onnivori, si nutrono principalmente di Insetti e di zooplankton, 
come già accennato in precedenza, ma la loro dieta include anche phytoplankton, spore, 
piccoli Artropodi, uova di Invertebrati e sembrerebbe, secondo alcune analisi stomacali, 
anche piccoli detriti, sabbia e fango (Spence et al., 2008). 
Una dieta così varia indica che il Danio rerio si alimenti sia dalla superficie che 
dal substrato acquatico; la maggioranza delle specie di Insetti di cui si nutre sono quelle 
a totale o parziale (una o più fasi larvali) vita acquatica, ma è possibile il consumo 
anche di specie terrestri che vivono nei pressi di corsi d’acqua dolce. Alimentandosi con 
larve di Insetti, il danio zebrato sembra svolgere un importante ruolo ecologico nel 
controllo della numerosità di alcune specie di Ditteri (Dutta, 1993). 
La dieta sembra differire in base al periodo dell’anno ma non è ancora stato 
chiarito se questo sia una diretta conseguenza della discontinua disponibilità delle prede 
o se rifletta un cambiamento stagionale nella preferenza alimentare della specie stessa 
(Spence et al., 2008). 
Essendo a loro volta ottime prede per altre specie acquatiche ed alcuni Uccelli 
piscivori, gli Zebrafish sono il fulcro della catena alimentare in diversi ecosistemi 
d’acqua dolce. Non ci sono invece informazioni disponibili riguardo le specie parassite 
infettanti (Engeszer et al., 2007). 
 
1.1.3. Sviluppo e dimorfismo sessuale 
 
Subito dopo la nascita (che avviene tra le 48 e le 72 ore dalla formazione dello 
zigote), nello stadio larvale precoce, il Danio rerio misura in media 3.5 mm in 
lunghezza ed è in grado di nuotare liberamente (Schilling, 2002).  
Dopo 30 giorni di sviluppo, la fase larvale è seguita dello stadio giovanile senza 
rilevanti cambiamenti metamorfici, fino alla fase adulta, ovvero dai 90 giorni in poi 
(Schilling, 2002).  Nelle primissime settimane, tutti gli individui posseggono gonadi 
femminili e in quelli di sesso maschile, dopo uno fase “intersessuale”, si differenziano i
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testicoli solo dopo il terzo mese di sviluppo. L’effettivo meccanismo biologico alla base 
della differenziazione sessuale in Zebrafish è ancora quasi del tutto sconosciuto. Per ora 
esistono evidenze che mostrano come l’alimentazione e soprattutto il tasso di crescita 
possono influenzare la determinazione sessuale: individui con un elevato tasso di 
crescita tendono a svilupparsi in femmine, quelli con un basso tasso di crescita in 
maschi. Ad ogni modo, stando ad alcuni studi effettuati in natura, la  sex ratio di questa 
specie sembra essere di 1:1 (Spence et al., 2008).  
Il tasso di crescita in Zebrafish è molto alto nei primi 3 mesi dopo la nascita, 
successivamente tende a decrescere fino ad arrestarsi dopo i 18 mesi di vita (Spence et 
al., 2007); animali allevati in cattività mostrano un alto tasso di crescita che si è estende 
nel tempo, con una vita media di 42 mesi, mentre in natura solitamente è di circa un 
anno (Spence et al., 2008). Anche se, individui cresciuti in cattività, a partire dal 
secondo anno di età, mostrano spesso una curvatura a livello spinale che non è stata 
rilevata in natura (Gerhard et al., 2002). 
In Danio rerio il dimorfismo sessuale è minimo [Fig.3]. Come detto, in linea 
generale gli individui di sesso maschile e femminile presentano la stessa colorazione, 
anche se i maschi tendono ad essere più scuri e con riflessi di un giallo più intenso 
(Schilling, 2002). Gli individui di sesso maschile solitamente presentano una pinna 
anale più grande rispetto alle femmine (Spence et al., 2008) e sembrano esserci 
differenze nella performance di nuoto in relazione a determinati parametri morfologici 
legati al sesso (Leris et al., 2013). 
 
 
Fig.3 In alto un Danio rerio di sesso femminile, in basso uno di sesso maschile 
(Vtichthyology.blogspot.it).
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La caratteristica più evidente riguardo il dimorfismo sessuale di questa specie, per 
lo meno per quel che concerne gli individui adulti, è la presenza nelle femmine 
sessualmente mature di un addome rigonfio, carico di numerosissime uova in via di 
sviluppo negli ovari (Schilling, 2002). Per gli individui in fase giovanile, invece, si può 
identificare il sesso solo a seguito di dissezione: le femmine presentano una piccola 
papilla genitale posizionata nei pressi dell’origine della pinna anale (Laale, 1977). 
Alcuni studi hanno anche dimostrato differenze dipendenti dal sesso nel 
trascrittoma sia per quel che riguarda l’intero organismo e sia nei singoli organi, come 
gonadi e fegato (Zheng et al., 2013).  
 
1.1.4. Capacità sensoriali 
 
Rispetto a tutti i sistemi sensoriali, quello meglio studiato in Zebrafish è il sistema 
visivo (Guo, 2004). La vista e tutti gli altri sistemi sensoriali tra cui l’olfatto, l’udito e i 
meccanocettori della linea laterale, permettono a questa specie di percepire l’ambiente 
circostante e di evitare eventuali predatori (Spence et al., 2008).  
Il riconoscimento dei cues visivi può essere molto importante per lo Zebrafish. 
Come altre specie acquatiche, è dotato di una messa a fuoco più potente rispetto alle 
specie terrestri, dato il differente indice refrattario di un mezzo come l’acqua, rispetto 
all’aria. Studi morfologici, fisiologici e molecolari hanno evidenziato la presenza di 
fotorecettori sensibili alla luce ultravioletta (UV, UltraViolet) nella retina del Danio 
rerio; i coni UV-sensitive sembrano i primi ad essere funzionali nello sviluppo larvale di 
questa specie (Nava et al., 2011). Oltre a quelli UV vi sono, ovviamente, anche altri 
fotorecettori sensibili alla radiazione luminosa con diverse lunghezze d’onda: coni rossi 
(onda lunga), verdi (onda media) e blu (onda corta). Gli Zebrafish sono quindi 
tetracromatici (Gestri et al., 2013). 
Per quel che riguarda la percezione olfattiva, essa coinvolge l’interazione degli 
odoranti con i recettori epiteliali ORs (Odorant Receptors): sono stati identificati circa 
100 geni che codificano per gli ORs in Zebrafish (Guo, 2004). Principalmente questa 
specie è in grado di percepire quattro classi di composti solubili in acqua: aminoacidi, 
acidi biliari, steroidi gonadici e prostaglandine (Laberge & Hara, 2001). 
In base agli effetti provocati sul comportamento animale, gli odoranti possono 
anche essere classificati in attrattori, repellenti o stimoli neutri. Danio rerio sembra
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essere attratto dagli aminoacidi, mentre il rame (Cu) sembra essere un repellente (Guo, 
2004). 
In termini di udito invece, sono state scoperte cellule specializzate direttamente 
nell’orecchio interno del danio zebrato. L’orecchio interno (come in tutti i Vertebrati), 
insieme ai sensori della linea laterale, svolgono un importante ruolo nel mantenimento 
dell’equilibrio e nella percezione di variazioni del flusso nel mezzo acquatico (Guo, 
2004). 
 
1.1.5. Specie modello: linee di ricerca 
 
Successivamente ai primordiali esperimenti nel campo della biologia molecolare 
durante gli anni ‘60, lo Zebrafish è stato utilizzato per la prima volta come specie 
modello in studi biologici a partire dal 1981, con il lavoro pionieristico di George 
Streisinger e del suo gruppo di ricerca (Streisinger et al., 1981). Da subito vennero 
riconosciuti i vantaggi nell’utilizzo del Danio rerio, tra i quali: tempi ridotti tra una 
generazione e l’altra, elevato numero di uova prodotte per ogni accoppiamento, facilità 
di allevamento e, data la fecondazione esterna, possibilità di studiare tutti gli stati di 
sviluppo di un individuo (Briggs, 2002).  
Nonostante l’ingente mole di studi pubblicati su questa specie, a differenza di 
Primati e Roditori in cui la maggior parte dei comportamenti sono stati accuratamente 
definiti, l’etogramma completo del danio zebrato non è stato del tutto sviluppato e 
chiarito (Kalueff et al., 2013). Per questo motivo, sono necessari ulteriori studi e 
osservazioni, soprattutto in natura, sulla sua etologia, fisiologia ed ecologia 
comportamentale. 
Per quel che riguarda le attuali linee di ricerca, lo Zebrafish viene utilizzato 
principalmente in Biologia dello Sviluppo, in Biologia e Genetica Molecolare, in 
Neuroscienze, in Fisiologia, nella Patologia Umana e in ultimo, ma non certo per 
importanza, in Eco-Tossicologia e Farmacologia (Goldsmith & Solari, 2003). Il numero 
di individui che a livello globale vengono utilizzati nei vari laboratori è impossibile da 
definire con esattezza; quello che si sa è che in molti Stati, ad esempio nel Regno Unito, 
il Danio rerio è la principale specie ittica utilizzata per studi scientifici (Home Office, 
2010).