Design e virtual screening di nuove molecole a potenziale attività antinfiammatoria

2 
 
 
 
Introduzione 
 
L’infiammazione è una reazione di difesa del nostro organismo ad un danno localizzato, 
che, unitamente al processo di riparazione, consente di ristabilire l’omeostasi iniziale. 
Fondamentalmente, è una risposta protettiva senza la quale, le infezioni non verrebbero 
controllate e le ferite non guarirebbero mai. L’infiammazione, detta anche flogosi, è un 
processo affascinante, finemente regolato che consta di tre fasi: una fase di innesco, una 
di amplificazione e una di risoluzione che porta alla guarigione completa. I segni cardini 
del processo infiammatorio sono cinque: rubor, tumor, calor, dolor e functio laesa. La 
parola rubor indica il processo di arrossamento, dovuto ad un aumento della 
vascolarizzazione. Per tumor si intende il gonfiore che si ha per essudazione di plasma e 
di cellule, mentre il termine calor indica il calore che si libera per vasodilatazione. 
Infine, il termine dolor rappresenta il dolore dovuto alla liberazione di fattori dolorifici, 
mentre la functio laesa è la perdita di funzionalità del tessuto interessato. Di questi 
cinque segni, quello variabile è il dolor in quanto la soglia del dolore cambia da 
individuo ad individuo.  
Il processo infiammatorio può presentarsi sotto due forme: acuta e cronica. 
Nell’infiammazione acuta, così come in quella cronica, la fase di innesco, dovuta ad una 
noxa patogena, attiva una risposta vascolare e cellulare mediata da fattori chimici 
derivati dal plasma e dalle cellule. L’infiammazione acuta è di breve durata e termina 
con la risoluzione dello stimolo dannoso e l’inibizione dei mediatori chimici, con 
guarigione rapida e completa. L’infiammazione cronica, invece, parte sempre da un
3 
 
infiammazione acuta, che per mancanza di risoluzione e guarigione si prolunga nel 
tempo. L’esito finale consiste nella deposizione di tessuto connettivale con formazione 
di una struttura fibrosa (Robbins, 1997). Riguardo ai mediatori chimici di origine 
cellulare, rivestono un ruolo importante i derivati dell’acido arachidonico. Esso fa parte 
degli acidi grassi polinsaturi essenziali ed è presente in forma esterificata soprattutto nei 
fosfolipidi di membrana. Esso, in risposta a stimoli  fisiologici, fisici e chimici, viene 
liberato per idrolisi da fosfolipasi di tipo A
2
 (PLA
2
). Successivamente, l’acido 
arachidonico, viene trasformato, ad opera di enzimi specifici o radicali liberi, in derivati 
che prendono il nome di eicosanoidi. Questi ultimi fanno parte della famiglia degli 
autoacoidi, cioè sostanze liberate da una cellula nell’ambiente extracellulare, dove, 
interagendo con recettori specifici, inducono delle risposte biologiche o sulla cellula che 
le ha prodotte o su altre cellule vicine, permettendo così la comunicazione intercellulare 
a breve distanza. Gli enzimi, come i radicali liberi, sintetizzano gli eicosanoidi, 
catalizzando reazioni ossidative. Ad oggi sono stati identificati quattro tipi di 
eicosanoidi: i prostanoidi, prodotti dall’enzima prostaglandina H sintasi (PGHS); gli 
acidi idrossieicosatetraenoici (HETE) ed i leucotrieni (LT), prodotti dall’enzima 
lipossigenasi; gli acidi epossieicosatetraenoici e gli acidi idrossieicosatetraenoici, 
prodotti dall’ enzima P-450 epossigenasi ed infine gli iso-eicosanoidi prodotti attraverso 
una perossidazione lipidica catalizzata dai radicali liberi (Clementi & Fumagalli, 2006) 
(fig.1).
4 
 
COOH
Acido arachidonico
PGHS
Lipossigenasi P-450 epossigenasi radicali liberi
prostanoidi leucotrieni
acidi epossi-
ed idrossi-eicosatetraenoici
acidi idrossi-eicosatetraenoici
iso-eicosanoidi
 
             Figura 1. Gli eicosanoidi derivati dall’acido arachidonico. 
 
Nel processo infiammatorio rivestono un ruolo chiave la via catalizzata dall’enzima 
PGHS e la via catalizzata dall’enzima lipossigenasi. In modo particolare, la conoscenza 
della via enzimatica catalizzata dalla PGHS (fig.2), che porta alla formazione dei 
prostanoidi, cioè prostaglandine e trombossani, è risultata essere di fondamentale 
importanza per lo sviluppo e la commercializzazione dei classici farmaci 
antinfiammatori.
5 
 
COOH
Acido arachidonico
O
O
OOH
COOH
PGG
2
O
O
OH
COOH
PGH
2
COOH
O
OH
OH
COOH
OH
OH
COOH
OH PGE
2
PGF
2α
HO HO
O
PGD
2
Fosfolipidi della membrana cellulare
Fosfolipasi A
2
cicloossigenasi (COX-1 e COX-2)
mPGES-1
mPGES-2
cPGES
perossidasi
in rosso la via seguita in risposta agli stimoli infiammatori
O
OH
COOH
HO
HO
TxA
2
O
COOH
HO
OH
PGI
2
PGH-Sintasi
 
Figura 2. La cascata dell’acido arachidonico nella biosintesi di prostaglandine e     
trombossani. 
 
Infatti, la biosintesi delle prostaglandine, in risposta a stimoli infiammatori, inizia per 
opera della fosfolipasi A
2,
 un enzima specifico che va ad idrolizzare il legame estereo 
sn-2 della fosfatidilcolina, liberando l’acido arachidonico nella cellula. 
Successivamente, quest’ultimo, per azione dell’enzima prostaglandina H sintasi 
(PGHS), forma un nuovo substrato, la  prostaglandina H
2
. L’enzima PGHS è dotato di 
due attività catalitiche, una ciclossigenasica, che porta alla formazione delle
6 
 
prostaglandine G
2
 (PGG
2
),  ed una perossidasica, che riduce le PGG
2
 a prostaglandine 
H
2
 (PGH
2
). Di questo enzima sono state caratterizzate due isoforme, la prostaglandina 
H-sintasi 1, detta anche ciclossigenasi-1 (COX-1), e la prostaglandina H-sintasi 2, 
conosciuta anche come clossigenasi 2 (COX-2). L’isoforma enzimatica COX-1 è 
espressa in forma costitutiva nel nostro organismo e svolge un’azione fisiologica 
importante nella formazione dei prostanoidi, coinvolti nella regolazione di funzioni 
gastrointestinali, piastriniche e renali. La COX-2 è, invece, l’isoforma enzimatica 
prevalentemente espressa in forma indotta, cioè in seguito a stimoli infiammatori, anche 
se in alcuni tessuti, quali rene e vasi, è presente in maniera costitutiva. Le PGH
2
, a loro 
volta, diventano nuovo substrato per l’azione di vari enzimi, responsabili della 
formazione di altre prostaglandine e trombossani. In particolare, grazie all’azione 
dell’enzima prostaglandina E-sintasi (PGE-Sintasi), anch’esso presente in più isoforme, 
due delle quali espresse in forma costitutiva (cPGES e mPGES-2) ed una in forma 
indotta (mPGES-1), le PGH
2 
vengono trasformate in PGE
2
. 
Le PGE
2
, sono coinvolte in processi sia fisiologici sia patologici. È stato infatti 
dimostrato che le PGE
2
, prodotte seguendo la via della COX-1, sono naturalmente 
prodotte nell’organismo. In particolare, esse sono presenti a livello dello stomaco, dove 
svolgono azione citoprotettiva, e a livello del rene, di cui regolano la funzionalità. Al 
contrario, le PGE
2
 derivanti dalla via delle COX-2, sono implicate nei processi 
infiammatori e tumorali.  
Da quanto descritto, è possibile individuare diversi possibili targets utili per la sintesi di 
molecole a carattere antinfiammatorio.  
In ordine cronologico, il primo ad essere stato individuato è la Fosfolipasi A
2 
(PLA
2
). 
Su tale enzima agiscono quelli che comunemente vengono chiamati farmaci 
antiinfiammatori steroidei (FAS) (fig.3). Questa classe di farmaci è rappresentata dai
7 
 
glucocorticoidi, il cui capostipite è il cortisone. Essi esplicano la loro azione 
essenzialmente promuovendo l’espressione genica della lipocortina 1, capace di inibire 
la fosfolipasi A
2
.  
Tuttavia, questi farmaci presentano un grosso limite. Agendo a monte della cascata 
dell’acido arachidonico, inibiscono la totale produzione di prostaglandine, il che si 
traduce nella comparsa di svariati effetti collaterali, alcuni dei quali anche gravi, a 
carico degli organi in cui le prostaglandine svolgono un ruolo funzionale, quali ad 
esempio l’ulcera gastrica. A ciò vanno poi aggiunti altri effetti collaterali non connessi 
al blocco della PLA
2
 e di cui ancora non risulta chiarita la causa, quali disordini 
endocrini e diabete. 
 
O
O
OH
OH
O
Cortisone
HO
O
OH
OH
O
Prednisolone
O
O
OH
OH
O
Betametasone
F
 
             Figura 3. Alcuni esempi di farmaci antinfiammatori steroidei (FAS). 
 
Targets più recenti sono gli enzimi COX-1 e COX-2, su cui agiscono i farmaci 
antinfiammatori non steroidei (FANS), una classe eterogenea di molecole che ha come 
capostipite l’aspirina (fig.4). La loro azione antinfiammatoria è dovuta alla capacità di 
inibire la COX-1 e la COX-2.
8 
 
COOH
OCOCH
3
Acido Acetilsalicilico
COOH
Ibuprofene
N
COOH
Cl
O
H
3
CO
Indometacina
NH
COOH
Diclofenac
Cl
Cl
N
COOH
O
Ketorolac
COOH
O
Ketoprofene
 
               Figura 4. Alcuni esempi di farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS).  
 
Tra questi farmaci, particolarmente interessante è risultato, in passato, il gruppo di 
molecole conosciuto come coxibs, capaci di inibire in modo selettivo e specifico la 
COX-2 (fig.5). Lo sviluppo di molecole con queste caratteristiche aprì la strada alla 
sintesi di molecole capaci di agire solo sulle prostaglandine indotte da stimoli 
infiammatori e sembrava aver dato una soluzione al problema dei classici effetti 
collaterali dei farmaci antinfiammatori non specifici. Purtroppo, studi di 
farmacovigilanza hanno dimostrato che queste promettenti molecole rivelano una 
elevata tossicità cardiovascolare se utilizzati per periodi prolungati e, pertanto, non 
possono essere impiegate nel trattamento di patologie infiammatorie croniche, quale 
l’artrite reumatoide.  
N
N
CF
3
H
2
NO
2
S
Celecoxib
O
O
H
3
CO
2
S
Rofecoxib
N
O
H
2
NO
2
S
Valdecoxib
 
             Figura 5. Alcuni esempi di Coxibs.
9 
 
Poiché il farmaco antinfiammatorio ideale dovrebbe essere quello che aumenta gli 
effetti benefici della flogosi controllando, nel contempo, le sue conseguenze distruttive 
e nocive, è risultato, necessario individuare un target alternativo alla COX-2, e la 
scoperta dell’enzima PGES, sembra essere la risposta a queste ricerche. 
L’individuazione di molecole capaci di inibire selettivamente l’isoforma indotta 
mPGES-1, infatti, permette di agire a valle della cascata dell’acido arachidonico e di 
bloccare solo la produzione di PGE
2
 indotte da stimoli infiammatori, senza modificare 
quelle naturalmente presenti. Sulla base di queste interessanti premesse, il mio lavoro di 
tesi si è rivolto al disegno ed alla sintesi di molecole quali potenziali inibitori 
dell’enzima mPGES-1.
10 
 
 
CAPITOLO 1 L’enzima mPGES1 
 
 
 
1.1  Enzima prostaglandina E-Sintasi (PGE-Sintasi). 
L’enzima prostaglandina E-sintasi è responsabile della trasformazione delle PGH
2
 in 
PGE
2
. 
Come descritto in precedenza, le PGE
2
 sono gli eicosanoidi più abbondanti presenti nel 
corpo umano e sono responsabili di svariate funzioni fisiologiche e patologiche. 
La PGE-sintasi è presente in tre isoforme: la cPGES, la mPGES-1 e la mPGES-2. 
L’isoforma cPGES è la forma citosolica dell’enzima mentre, le altre due, sono le forme 
microsomiali. La cPGES e la mPGES-2 sono due isoforme costitutive, sempre presenti 
nel nostro organismo. In particolare, la cPGES produce PGE
2
 a partire dalle PGH
2
 
formate dall’enzima COX-1, mentre la mPGES-2 produce PGE
2
 a partire dalle PGH
2
 
formate sia dall’enzima COX-1 che dall’enzima COX-2. Al contrario, l’isoforma 
enzimatica mPGES-1 è principalmente espressa in risposta a stimoli pro-infiammatori e 
produce PGE
2
 a partire dalle PGH
2,
 formate dall’enzima COX-2 (Samuelsson et al., 
2007). È proprio quest’ultima caratteristica a rendere l’mPGES-1 un target 
particolarmente interessante. Infatti, la sua inibizione determina la fine del processo 
infiammatorio senza le conseguenze tipiche degli altri antinfiammatori in commercio, 
quale in particolar modo l’ulcera gastrica.   
 
1.2 Enzima mPGES-1: identificazione, distribuzione e patologie in cui è coinvolto. 
L’enzima mPGES-1 (fig.6) è stato identificato per la prima volta nel 1999 (Jakobsson, 
et al., 1999). Esso fa parte di un complesso di proteine di membrana appartenenti alla
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superfamiglia MAPEG (Membrane associated proteins involved in eicosanoid and 
glutathione metabolism). Strutturalmente l’enzima è una proteina di membrana, un 
trimero di cui ogni monomero presenta quattro eliche trans-membrana. In presenza di 
un cofattore essenziale, il glutatione ridotto (GSH), l’mPGES-1, attraverso una reazione 
di isomerizzazione ed una successiva di endoperossidazione, trasforma le PGH
2
 in 
PGE
2
. Come ribadito, l’mPGES-1 è essenzialmente una isoforma inducibile in presenza 
di citochine pro-infiammatorie. È stato infatti dimostrato che nei pazienti con artrite 
reumatoide, i livelli dell’espressione dell’enzima nella membrana sinoviale che riveste 
le articolazioni aumentano con l’aumentare della gravità della malattia (Murakami et 
al., 2003; Westman et al., 2004). Ciononostante, studi recenti hanno dimostrato che, a 
bassi livelli, in alcuni organi, quali polmone, milza, rene e stomaco di topi, è espresso in 
maniera costitutiva (Boulet et al., 2004).     
Oltre alle patologie più strettamente infiammatorie, quali le patologie artritiche, e al 
dolore per i quali l’inibizione selettiva dell’mPGES-1 può essere un valido ed effettivo 
approccio terapeutico, tale enzima sembra essere coinvolto in svariate altre patologie.  
In primo luogo, studi recenti hanno dimostrato che l’aumento della produzione delle 
PGE
2
, che si verifica con la comparsa di alcune forme tumorali, quali il cancro al colon-
retto e alla mammella, nonché il tumore del polmone a piccole cellule è dovuta ad una 
over-espressione dell’enzima mPGES-1 (Yoshimatsu et al., 2001; Yoshimatsu, Altorki 
et al., 2001; Mehrotra et al., 2006). 
In aggiunta, come dimostrato da studi condotti sui topi, la formazione di placche 
aterosclerotiche (Wang et al., 2006), nonché la comparsa dell’ischemia cardiaca e 
cerebrale, patologie che vedono coinvolto un processo infiammatorio, sembrano essere 
connesse all’aumento dell’espressione degli enzimi COX-2 e mPGES-1 (Nilupul 
Perrera et al., 2006; Ikeda-Matsuo et al., 2006).