Costruzione e caratterizzazione di una immuno-RNasi con attività antitumorale

  
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I requisiti necessari perché una immunotossina sia non solo 
efficace, ma anche utilizzabile come potenziale farmaco nell’uomo 
sono tre: 
1- la capacità dell’anticorpo di discriminare tra cellule normali e 
tumorali, e cioè la capacità di riconoscere molecole di superficie che 
siano il più possibile “tipiche” delle cellule tumorali (antigeni 
tumorali) 
2- l’efficienza della tossina nell’indurre la morte della cellula 
bersaglio  
3- la capacità del costrutto intero, l’immunotossina, di essere 
tollerato dal sistema immunitario dell’uomo.   
Numerose tossine isolate da piante o batteri sono state utilizzate 
per la costruzione di immunotossine. Tra queste la ricina, la 
esotossina A e la tossina difterica ( 1) sono state fuse ad una porzione 
anticorpale  per produrre immunotossine, con le quali si sono ottenuti 
risultati molto promettenti sia in vitro, su cellule tumorali, che in 
vivo, su animali da laboratorio. 
 Nonostante ciò queste immunotossine non hanno una possibile 
applicazione clinica (22) in quanto, essendo costituite da proteine 
batteriche o isolate da piante, sono risultate fortemente 
  
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immunogeniche per l’uomo. Inoltre non sempre la loro specificità di 
bersaglio è soddisfacente a causa della tossicità delle tossine su 
cellule di altri tessuti. 
Con la tecnologia del DNA ricombinante si è tentato di ottenere 
immunotossine più potenti, meno immunogeniche e di dimensioni 
più ridotte. 
Per esempio la esotossina A da Pseudomonas è stata 
geneticamente alterata nella porzione N-terminale, responsabile del 
legame alla superficie cellulare, per rendere la tossina più efficiente 
(2); la sequenza C-terminale della stessa tossina (REDLK) è stata 
sostituita con la sequenza KDEL, una sequenza consenso per la 
ritenzione nel reticolo endoplasmatico che, facilitando l’ingresso 
della proteina in questo compartimento cellulare, ne aumenta 
l’azione tossica. 
Inoltre la sostituzione dell’intero anticorpo con un frammento di 
esso che contiene le regioni responsabili del riconoscimento 
dell’antigene (le regioni variabili), ha grandemente semplificato la 
strategia di costruzione delle immunotossine, portando inoltre ad una 
significativa riduzione delle loro dimensioni, ad una maggiore 
  
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permeazione dei tessuti, con un grosso guadagno per le future 
applicazioni cliniche.  
In Figura 1 è riportata schematicamente la struttura del 
frammento anticorpale contenente la regione variabile della catena 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  
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Figura 1.  La struttura di un frammento sFv contenente le 
regioni V
H
 e V
L
 di un sito legante dell’anticorpo. 
 
 
 
  
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 pesante (V
H
) legata mediante un oligopeptide di collegamento alla 
regione variabile della catena leggera (V
L
). In tale modo i due domini 
che nell’anticorpo costituiscono uno dei due siti di legame per 
l’antigene vengono a trovarsi collegati in un unico frammento 
peptidico, anzichè appartenere a due catene proteiche distinte, la 
catena pesante e quella leggera. A tale frammento a singola catena è 
stato dato il nome di sFv (o scFv). 
Una classe di tossine che è stata usata con successo per la 
costruzione di immunotossine è quella delle ribotossine, o proteine 
che inattivano i ribosomi. Queste proteine sono ribonucleasi, come la 
α-sarcina, la mitogillina, e la restrictocina prodotte da ceppi 
differenti del fungo Aspergillus (3). Sono potenti inibitori del sistema 
di traduzione delle proteine perché producono il taglio di un singolo 
legame fosfodiestereo dell’RNA ribosomale 28S. 
 Le ribotossine sebbene siano capaci di inattivare i ribosomi di 
tutti gli organismi compreso l’uomo, non riconoscono recettori sulla 
superficie cellulare, e per manifestare la loro potente citotossicità 
devono essere introdotte artificialmente nelle cellule, come è stato 
fatto per l’α-sarcina, introdotta per microiniezione nelle uova di 
Xenopus laevis. 
  
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Immunotossine costruite a partire da ribotossine hanno dato 
risultati interessanti su diverse linee cellulari tumorali. Tra queste 
immunotossine sembra particolarmente interessante quella costruita 
da Rathore e Batra (3), utilizzando come porzione tossica la 
restrictocina, una ribotossina isolata dal fungo Aspergillus restrictus, 
e come porzione anticorpale la porzione sFv dell’anticorpo diretto 
contro il recettore umano della trasferrina, un recettore identificato 
come antigene tumorale perché espresso ad alti livelli sulla superficie 
di cellule tumorali. L’attività della immunotossina è stata saggiata su 
numerose linee cellulari umane sia tumorali che normali. Si è trovato 
che l’inibizione della sintesi proteica indotta da tale costrutto si 
verifica solo per le cellule tumorali, ma non per quelle normali. 
Un’altra ribotossina, la clavina, presente nel fungo Aspergillus 
clavatus è stata legata chimicamente all’anticorpo monoclonale 
MgR6 (4) che riconosce il dominio extracellulare del recettore 
ErbB2. Tale recettore è un antigene tumorale espresso ad alti livelli 
in numerosi adenocarcinomi umani, come quello della mammella, 
dell’ovaio, dello stomaco e del polmone. Si è dimostrato che la sua 
presenza è sempre associata con una fase più aggressiva della 
crescita tumorale. Pertanto la sua espressione in cellule tumorali e la 
  
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sua accessibilità extracellulare fanno del recettore ErbB2 un 
bersaglio molto promettente per la terapia dei tumori.  
Risultati positivi sono stati ottenuti con questa immunotossina 
saggiata su una linea cellulare da adenocarcinoma mammario, la 
linea SKBR3, cellule ErbB2 positive. Infatti l’immunotossina è 
risultata letale per le cellule anche a una concentrazione molto bassa 
(10
-9
 M) 
Sulla base di questi risultati positivi, D’Alatri et al. (5) hanno 
costruito, mediante le tecniche del DNA ricombinante, un’altra 
versione della immunotossina descritta precedentemente in cui la 
porzione anticorpale è costituita dalla porzione sFv dell’anticorpo 
MgR6 anti-recettore ErbB2, piuttosto che dall’intero anticorpo. 
Questa nuova versione dell’immunotossina, avendo rispetto al 
coniugato chimico il vantaggio di una più piccola taglia, è 
potenzialmente di maggiore interesse farmacologico per la probabile 
maggiore facilità di penetrazione in una massa tumorale, prechè 
potrebbe avere una più rapida distribuzione in vivo e una vita media 
più lunga.  
Si è dimostrato che questa immunotossina è capace di 
riconoscere specificamente il recettore ErbB2 presente sulle cellule 
  
12
SKBR3 (5), ma non viene internalizzata nelle cellule. Tali risultati 
possono essere spiegati ipotizzando che la presenza sul frammento 
sFv di un solo sito di legame per l’antigene, piuttosto che due siti 
come sull’anticorpo intero, non favorisce l’associazione in dimeri 
delle molecole di recettore ErbB2, associazione richiesta per 
l’internalizzazione (6). 
 Altri ricercatori Wels et al (7) sono invece riusciti ad ottenere 
risultati soddisfacenti utilizzando una immunotossina costituita dalla 
esotossina A legata a un frammento sFv di un altro anticorpo 
monoclonale (FRP5) diretto contro lo stesso recettore ErbB2. 
Esperimenti in vitro di legame tra l’antigene e l’anticorpo hanno 
infatti dimostrato che tale costrutto ha azione citotossica per le 
cellule in coltura in quanto ne inibisce la sintesi proteica; esperimenti 
in vivo condotti su un tumore (carcinoma umano) indotto in topi, in 
cui il sistema immunitario è stato inibito, hanno dimostrato una 
significativa inibizione della crescita del tumore. 
Deonarain e Epenetos (8) hanno invece utilizzato come porzione 
tossica di una immunotossina la ribonucleasi seminale bovina (BS-
RNasi), isolata e caratterizzata nel nostro laboratorio (9). Tale 
proteina è di per sé tossica per le cellule tumorali, come si è potuto 
  
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dimostrare sia in vitro sia in vivo (23). Gli autori hanno preparato una 
serie di costrutti contenenti la BS-RNasi legata al frammento sFv di 
un anticorpo diretto contro la fosfatasi alcalina, un altro antigene 
tumorale. Questi costrutti differiscono tra loro poiché presentano 
regioni di diversa lunghezza tra l’sFv e sono dotati o non della 
sequenza KDEL.  
Questi risultati indicano che le immunotossine, in cui la porzione 
tossica è costituita da una ribonucleasi, che verranno d’ora in poi 
indicate come immunoRNasi, rappresentano un’arma efficace contro 
le cellule maligne. 
 Come si è detto precedentemente, un problema cruciale per 
l’utilizzo delle immunotossine come farmaci anti-cancro nell’uomo è 
la loro immunogenicità. Poiché infatti la porzione anticorpale deriva 
in genere da anticorpi monoclonali prodotti da ibridomi di topo, e la 
porzione tossica della maggiore parte delle immunotossine deriva da 
organismi diversi batteri, funghi o piante, il costrutto chimerico 
evoca con ogni probabilità una risposta immunitaria nell’uomo. 
 Per questo motivo Rybak e altri ricercatori hanno costruito una 
serie di immunoRNasi in cui la porzione tossica è costituita da una 
ribonucleasi di origine umana e quella anticorpale è costituita dalla 
  
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porzione sFv di un anticorpo murino. Le ribonucleasi umane 
utilizzate sono state l’angiogenina (10), l’EDN (eosinophil-derived 
neurotoxin) (11) e la HP-RNasi, la ribonucleasi pancreatica umana 
(12). Gli stessi autori hanno costruito diverse versioni della 
immunotossina contenente l’angiogenina (10) e hanno dimostrato 
che la versione in cui il segmento che connette il frammento V
H
 a 
quello V
L
 è costituito da una sequenza di 15 residui (GGGGS)
3, 
ed in 
cui è presente inoltre un tratto spaziatore, interposto tra il frammento 
sFv e la ribonucleasi, è quella più affine al recettore e più potente 
come agente citotossico.  
Ciò nonostante si è dimostrato che i costrutti con l’EDN e 
l’angiogenina legati all’anticorpo contro il recettore per la trasferrina 
causano effetti collaterali negli animali trattati che potrebbero 
compromettere l’uso di queste immunotossine. È stata anche 
costruita una nuova immnunoRNasi  in cui il frammento sFv 
dell’anticorpo diretto contro il recettore della trasferrina è stato 
legato alla ribonucleasi pancreatica umana HP-RNasi (12). Si può 
presumere che tale ribonucleasi, di per sé non tossica essendo di 
origine umana, se somministrata all’uomo non induca una risposta 
immunitaria. Inoltre se coniugata con un anticorpo che riconosce 
  
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selettivamente le cellule tumorali, essa può diventare una potente 
citotossina per le cellule che esprimono il recettore. Infatti si è 
dimostrato che tale immunoRNasi sFv è in grado di inibire la sintesi 
proteica in diverse linee cellulari umane derivate da melanoma, 
carcinoma renale e da quello mammario, anche utilizzando 
concentrazioni molto basse di immunoRNasi. 
Scopo della tesi. 
Sulla base dei risultati positivi ottenuti con le immunoRNasi si è 
pensato di costruire una immunoRNasi contenente la ribonucleasi 
pancreatica umana (HP-RNasi ) e il frammento sFv dell’anticorpo 
monoclonale MgR6 (5) diretto contro il recettore ErbB2. Tale 
costrutto infatti può essere di grande interesse farmacologico per la 
presenza di una proteina di origine umana che svolge la funzione di 
tossina e di un anticorpo molto selettivo per le cellule tumorali 
derivanti da adenocarcinomi, in particolare quelli della mammella. 
Scopo di questa tesi è quindi la costruzione, espressione e 
caratterizzazione di una immunoRNasi, indicata con la sigla   sFvM-
L15-HP, sulla base delle entità che lo compongono: la porzione 
anticorpale derivante dall’anticorpo MgR6 (M), la ribonucleasi HP-
RNasi (HP), la regione spaziatrice interposta tra la tossina e 
  
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l’anticorpo, lunga 15 residui (L15). Questo lavoro di tesi si propone 
inoltre di affrontare il problema di una efficiente internalizzazione 
del costrutto in cellule tumorali che esprimono il recettore ErbB2. 
Infatti, come si è detto, l’internalizzazione dell’anticorpo è mediata 
da un evento di dimerizzazione del recettore, evento che è reso 
possibile dalla presenza di due siti di legame per l’antigene sulla 
molecola dell’immunoglobulina, i quali, riconoscendo ciascuno una 
molecola di recettore, favoriscono l’aggregazione di due molecole in 
una struttura dimerica. Poiché il frammento sFv presenta un solo sito 
di legame per l’antigene, si è pensato di ingegnerizzare la 
immunoRNasi, in modo tale che presenti due siti combinatori per 
l’antigene. 
Questo è possibile quando l’oligopeptide che connette la regione 
variabile della catena pesante con quella della catena leggera è 
sufficientemente corto da non permettere l’appaiamento 
intramolecolare delle stesse (vedi Figura 1 ), (13) e da indurre invece 
l’appaiamento intermolecolare tra due diversi sFv. Il risultato 
dell’appaiamento forzato tra porzioni anticorpali di due molecole 
diverse porta alla formazione di “diabodies” ovvero di frammenti 
  
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anticorpali bivalenti, cioè dotati di un doppio sito di riconoscimento 
per l’antigene (14).   
Pertanto lo scopo di questa tesi è duplice:la costruzione della 
immunoRNasi sFvM-L15-HP, la sua espressione, l’isolamento e la 
caratterizzazione, nonché la costruzione di una sua variante in cui il 
segmento congiungente le regioni V
H  
e
 
V
L 
è accorciato da 15 residui 
amminoacidici, a 5 residui. Tale variante è stata chiamata sFvM-L5-
HP.