Confronto fra metodi di estrazione del DNA da matrici alimentari e ricerca qualitativa di geni OGM

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CAPITOLO 1 
INTRODUZIONE 
LA SCOPERTA DEL DNA 
La genetica classica nasce nella seconda metà dell’800 con gli studi compiuti su piante 
di pisello da un monaco del monastero di Brno, in Moravia: Gregor Mendel[1] noto 
anche come "il padre della genetica". I suoi esperimenti di selezione artificiale su 
piante di pisello lo portarono a formulare le "leggi dell'ereditarietà", un modello 
intuitivo che ha permesso di comprendere tutti i processi che per molto tempo erano 
stati usati dagli agricoltori e dagli allevatori per la selezione artificiale di piante ed 
animali. 
Fin dall'inizio dei suoi studi Mendel si era posto un preciso obbiettivo cioè di dare una 
risposta alla seguente domanda: "in che modo i caratteri si trasmettono dai genitori ai 
figli?". I suoi esperimenti si basavano sulla seguente ipotesi: ciascun carattere fenotipico 
è determinato da due "fattori" (alleli), ciascuno proveniente da uno dei due genitori.  
Mendel utilizzava ceppi puri, cioè piante che autofecondandosi mantenevano lo stesso 
carattere per molte generazioni; inoltre all'inizio prese in considerazione piante che 
differivano tra loro per un solo carattere, quali ad esempio il colore del seme (giallo in 
una, verde nell'altra). A questo punto procedeva all'incrocio vero e proprio, ovvero alla 
impollinazione incrociata, e notò che tutti i discendenti della prima generazione (F1) 
presentavano semi gialli, il carattere verde sembrava scomparso. Egli dedusse che il 
giallo doveva essere dominante rispetto al verde, considerato recessivo.  
Incrociando successivamente tra loro le piante della generazione (F1) Mendel ottenne la 
seconda generazione filiale (F2), costituita per 3/4 da piante che continuavano a 
presentare il carattere di F1 e per 1/4 dal carattere presente nella generazione delle linee 
pure P apparentemente scomparso nella F1. Mendel eseguì anche incroci di ibridi (cioè 
considerò due caratteri contemporaneamente, ottenendo dei risultati analoghi. 
Al termine degli esperimenti arrivò alle seguenti conclusioni: 
1. I caratteri non si mescolano negli ibridi ma mantengono la propria identità. 
2. Ogni carattere è controllato da una coppia di “fattori” ereditari, che vegono 
      trasmessi uno da ciascun genitore, ai figli attraverso i gameti.  
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Oggi si sa che  questi fattori sono i GENI, che sono presenti nel cromosoma in una delle 
due forme alternative, dette ALLELI, delle quali una (allele dominante) prevale 
sull’altra (allele recessivo), mascherandone la presenza nella F1. 
Mendel aveva fatto luce sui meccanismi che regolano la trasmissione dei carateri 
ereditari. Il passo successivo era quello di analizzare la struttura dei geni e DNA. 
il DNA fu inizialmente isolato dal biochimico svizzero Friedrich Miescher che, nel 
1869, presso i laboratori di Felix Hoppe-Seyler a Tubinga individuò la presenza di vari 
composti chimici ricchi in fosfato all'interno dei nuclei dei leucociti, contenuti nel pus 
di bende chirurgiche utilizzate. Dal momento che tale molecola aveva la sua 
localizzazione nel nucleo, la chiamò nucleina.[2]  
Egli aprì la strada all'identificazione del DNA come molecola responsabile della 
conservazione e della trasmissione dei caratteri ereditari. La significatività di tale 
scoperta, pubblicata nel 1871, non fu immediatamente chiara e solo alla fine degli anni 
ottanta il biologo Albrecht Kossel proseguì lo studio su questi composti, investigandone 
più nel dettaglio le strutture chimiche.                                                             
Nel 1919 Phoebus Levene individuò la struttura del nucleotide, composta da base 
azotata, zucchero e fosfato. Levene identificò i componenti del DNA (scoprì il ribosio 
nel 1909 ed il deossiribosio nel 1929), e formulò alcune ipotesi sulla struttura del DNA 
che si rivelarono corrette. Egli mise in luce la disposizione dei componenti secondo la 
sequenza ripetuta fosfato-zucchero-base, unità che chiamò per la prima volta 
nucleotide, ed ipotizzò che le molecole di DNA non fossero altro che filamenti 
composti da nucleotidi collegati tra loro attraverso i gruppi fosfato, considerati lo 
scheletro del DNA stesso. Le sue idee complessive sulla struttura del DNA non si 
rivelarono tuttavia corrette: egli infatti riteneva anche che ci fossero solo quattro 
nucleotidi per molecola e, per tale motivo, escluse che il DNA potesse essere il vettore 
dell'informazione genetica, perché la riteneva una molecola troppo semplice per tale 
scopo. In ogni caso, il lavoro di Levene fu fondamentale per delineare la vera struttura 
del DNA. 
Nel 1928 Griffith, attraverso quello che oggi è noto come “esperimento di Griffith”, 
propose la presenza di un principio trasformante[3] alla base della trasformazione 
batterica, e tale esperimento aprì la strada alla scoperta del DNA come molecola 
contenente l'informazione genetica. Griffith stava lavorando alla messa a punto di un 
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vaccino contro le frequenti epidemie di polmonite esplose in Gran Bretagna al termine 
della Prima Guerra Mondiale. Egli stava utilizzando due linee del batterio Streptococcus 
pneumoniae: una, definita rugosa (R), che non era in grado di indurre la malattia; l'altra, 
liscia (S), dotata di capsula polisaccaridica, induceva la patologia. Tuttavia queste 
cellule se inattivate ad alte temperature, non erano in grado di indurre patologia in 
seguito ad iniezione in topi; la patologia insorgeva invece in seguito all'iniezione di una 
miscela in cui erano presenti batteri vivi R e batteri morti S (uccisi da trattamento 
termico). Iniettò questa miscela in un topo e quello che ci si aspettava era la NON 
comparsa di malattia nell'animale (dal momento che non sarebbero dovute sussistere le 
condizioni appena citate) ma in realtà il topo si ammalò e morì, e nei suoi tessuti si 
riscontrarono batteri S. Griffith isolò i batteri dal sangue dell'animale e scoprì che gli R 
avevano acquisito la capsula ed erano in grado di mantenerla lungo le generazioni. 
Griffith ipotizzò dunque la presenza di qualche principio trasformante in grado di 
trasferirsi dalla linea S inattivata a quella R. Questo sistema, pur non fornendo nessuna 
evidenza su quale fosse la sostanza che determinava il cambiamento, mostrava 
comunque che qualcosa potesse trasportare l'informazione genetica dai resti dei batteri 
morti a quelli vivi. Si parlò quindi di un principio trasformante in grado di modificare i 
batteri vivi. Solo alcuni anni più tardi fu chiaro che quel principio fosse il DNA. Griffith 
morì durante un raid aereo su Londra, mentre era al lavoro con il collega e amico 
William Scott. Morì stringendo in mano un foglio contenente formule che sembravano 
riferirsi ad una imminente scoperta rivoluzionaria. In ogni caso, i suoi appunti si 
rivelarono troppo scarni per essere interpretati. Quegli appunti sono tuttora conservati, 
in modo che qualcuno sia in grado di interpretarli e completare il lavoro di Griffith. 
Nel 1951 Rosalind Franklin, lavorando con il suo studente Raymond Gosling, iniziò ad 
applicare le sue competenze a proposito delle tecniche di diffrazione a raggi x per la 
struttura del DNA. Scoprirono che vi sono due forme di DNA: quando è bagnato il 
DNA assume l’aspetto di una fibra lunga e sottile, quando è asciutto, diventa corto e 
grosso. Le foto scattate da Franklin con la diffrazione a raggi x furono definite da John 
Desmond Bernal "tra le più belle fotografie a raggi x di qualsiasi sostanza mai 
scattate". Nel 1953 James Watson e Francis Crick presentarono sulla rivista Nature[4]           
(una delle più antiche ed importanti riviste scientifiche esistenti, forse in assoluto quella 
considerata di maggior prestigio nell'ambito della comunità scientifica internazionale 
insieme a Science), quello che oggi è accertato come il primo modello accurato della 
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struttura del DNA: struttura a doppia elica. A disegnarne il bozzetto fu Odile Speed, 
pittrice e moglie di Crick. Nel 1962, dopo la morte di Rosalind Franklin[5] (a causa di un 
tumore provocato, probabilmente, dalle alte dosi di raggi X a cui si era esposta nel corso 
dei suoi esperimenti), Watson, Crick e Wilkins ricevettero congiuntamente il Premio 
Nobel per la medicina. In una importante presentazione del 1957, Crick propose il 
cosiddetto dogma centrale della biologia molecolare, che è il principio secondo il quale                                                                                                                                                                                                                                                                                              
il flusso dell'informazione genetica è monodirezionale e parte dagli acidi nucleici per 
arrivare alle proteine. In questo processo sono identificabili tre punti:  
 ξ l'informazione genetica è conservata nel DNA, che viene trascritto sotto forma 
di RNA, il quale viene successivamente tradotto a proteine. 
 ξ La forma "operativa" dell'informazione contenuta nel genoma. Questo 
costituisce il meccanismo di base dell'espressione dei geni. 
 ξ La direzione fondamentale del flusso di informazione genetica. 
Si ricordano inoltre altre date importanti:[6]  
- Nel 1972 viene ottenuta la prima ricombinazione da Berg, Jackson e Symons. 
Ciò viene ritenuto come l'atto di fondazione dell'ingegneria genetica. Essi 
ottengono in vitro una molecola ibrida: Una volta individuato il metodo per 
creare un DNA ricombinante.  
- Nel 1973 Cohen, Boyer, Helling e Clang costituiscono in vitro un plasmide 
ricombinante che, reinserito nel batterio, si dimostra biologicamente funzionante 
sia che vengano inseriti geni della stessa specie, sia di specie diversa e superiore, 
come ad esempio i geni umani.  
- Nel 1977 è nata Louise Brown, la prima “figlia della provetta”. 
- Nel 1978 viene clonato il gene umano dell’insulina. 
- Nel 1985 viene messa a punto la tecnica della PCR. 
- Nel 1987 viene prodotto il primo pomodoro geneticamente modificato, 
resistente ai parassiti. 
- Nel 1996 con la clonazione della pecora Dolly, veniva aperta la strada ad una 
possibile clonazione umana, al centro di violente polemiche. 
- Nel 2002 la Gran Bretagna legalizza la clonazione terapeutica, ovvero la 
creazione di un embrione in vitro, mediante clonazione, per studiare le malattie 
umane, e sviluppare nuove terapie. 
 
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1.1 STRUTTURA DEL DNA 
L'acido desossiribonucleico o deossiribonucleico (DNA) è un acido nucleico che 
contiene le informazioni genetiche necessarie alla biosintesi di RNA e proteine, 
molecole indispensabili per lo sviluppo ed il corretto funzionamento della maggior parte 
degli organismi viventi. Gli acidi nucleici,[7] sono acidi presenti nel nucleo della cellula, 
deputati alla conservazione e trasmissione dell'informazione biologica nei viventi. Negli 
organismi viventi si trovano due tipi di acidi nucleici: 
 ξ DNA (acido desossiribonucleico)  
 ξ RNA (acido ribonucleico)  
Il DNA è il depositario dell'informazione genetica che viene trascritta (cioè copiata) in 
molecole di RNA. L'RNA contiene il codice per sintetizzare specifiche proteine.                  
Dal punto di vista chimico, il DNA è un polimero organico costituito da monomeri 
chiamati nucleotidi. Tutti i nucleotidi sono costituiti da tre componenti fondamentali: un 
gruppo fosfato, uno zucchero pentoso ed una base azotata che si lega al deossiribosio 
con legame N-glicosidico. Le basi azotate che possono essere utilizzate nella 
formazione dei nucleotidi si dividono in due gruppi: puriniche (adenina e guanina); 
pirimidiniche (citosina, timina e uracile).  
La principale differenza tra DNA e RNA è lo zucchero pentoso: l'RNA utilizza, infatti, 
il ribosio, mentre il DNA, possiede il desossiribosio. 
 
Fig.1 - Struttura delle basi azotate del DNA 
 
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Le basi azotate che costituiscono il DNA (vedi figura 1) sono: adenina(A), guanina(G), 
citosina(C) e timina(T). Le basi azotate che costituiscono l'RNA sono: adenina(A), 
guanina(G), citosina(C) e uracile(U). Nei batteri e nelle cellule di organismi superiori, 
sono presenti entrambi, e virus possiedono invece o solo l'RNA (ad esempio quello 
della poliomielite o quello dell'AIDS), o solo il DNA. Negli eucarioti, il DNA si trova 
nel nucleo e nel mitocondrio, mentre l'RNA nel nucleo, ma soprattutto nel citoplasma. 
Al DNA spetta il mantenimento dei caratteri ereditari, mentre all'RNA altre mansioni, 
quale la trasmissione delle informazioni contenute nel DNA verso i siti di sintesi 
proteica. Negli organismi viventi, il DNA non è quasi mai presente sotto forma di 
singolo filamento, ma come una coppia di filamenti saldamente associati tra loro, essi si 
intrecciano tra loro a formare una struttura definita doppia elica.  
Ogni nucleotide è costituito da uno scheletro laterale, che ne permette il legame 
covalente con i nucleotidi adiacenti, e da una base azotata, che instaura legami idrogeno 
con la corrispondente base azotata presente sul filamento opposto ( le basi azotate sono 
complementari l’una all’altra). Il composto formato da una base azotata legata allo 
zucchero è definito nucleoside; un nucleotide è invece un nucleoside a cui sono legati 
uno o più gruppi fosfato. La struttura laterale del DNA è composta da unità ripetute ed 
alternate di gruppi fosfato e di 2-deossiribosio, uno zucchero pentoso (a cinque atomi di 
carbonio) che si lega ai fosfati adiacenti attraverso legami fosfodiesterici presso il terzo 
ed il quinto carbonio, in pratica, ogni molecola di fosfato forma un ponte molecolare 
collegando, attraverso legami fosfodiesterici, il carbonio in posizione 3′ di una molecola 
di deossiribosio con quello in posizione 5′ dello zucchero successivo. I due filamenti 
che costituiscono la doppia elica del DNA, o DNA duplex sono antiparalleli, cioè i loro 
legami fosfodiesterici, concorrono in direzioni opposte. Le estremità asimmetriche di un 
filamento di DNA sono definite estremità 5′ (cinque primo) ed estremità 3′ (tre primo).  
Un importante proprietà del DNA è il SUPERAVVOLGIMENTO ovvero avvolgimento 
di qualcosa che è già avvolto: il DNA è avvolto in forma di una doppia elica nella quale 
entrambe le catene avvolte ruotano intorno ad un asse. Un ulteriore ripiegamento o una 
torsione di tale asse su se stesso determina un superavvolgimento del DNA, contrario, 
se non vi è alcun ripiegamento dell’asse su se stesso, si dice che il DNA è in uno stato 
rilassato.   
                                                                                                 
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1.1.1 APPAIAMENTO DELLE BASI 
Ogni tipo di base presente su un filamento forma un legame con la base complementare 
posta sul filamento opposto. Tale evento è noto come appaiamento complementare.  
Le basi puriniche formano legami idrogeno con le basi pirimidiniche: A può legare solo 
T e G può legare solo C.  
L'associazione di due basi viene comunemente chiamata paia di basi (pb) ed è l'unità di 
misura maggiormente utilizzata per definire la lunghezza di una molecola di DNA (vedi 
figura 2).  
Dal momento che i legami idrogeno non sono covalenti, possono esser rotti e riuniti in 
modo relativamente semplice. I due filamenti possono essere allontanati tra loro, come 
avviene per una cerniera, sia dalle alte temperature che da un'azione meccanica (come 
avviene durante la replicazione del DNA). Conseguenza di questa complementarità è 
che tutte le informazioni contenute nella doppia elica possono essere duplicate a partire 
da entrambi i filamenti, evento fondamentale per una corretta replicazione del DNA.  
I due tipi di paia di basi formano un numero differente di legami idrogeno: A e T ne 
formano due, G e C tre. Per tale motivo, la stabilità del legame GC è decisamente 
maggiore di quello AT. Di conseguenza, la stabilità complessiva di una molecola di 
DNA è direttamente correlata alla frequenza di GC presenti nella molecola stessa, 
nonché alla lunghezza dell'elica: una molecola di DNA è dunque tanto più stabile 
quanto più contiene GC ed è lunga.  
Un'altra conseguenza di tale evento è il fatto che le regioni di DNA che devono essere 
separate facilmente contengono un'elevata concentrazione di A e T. In laboratorio, la 
stabilità dell'interazione tra filamenti è misurata attraverso la temperatura necessaria a 
rompere tutti i legami idrogeno, chiamata temperatura di melting (o Tm). La Tm è 
definita come la temperatura alla quale la metà del DNA si trova nello stato a doppia 
elica, e la metà in quello denaturato (random-coil). La temperatura di melting dipende 
sia dalla lunghezza totale della molecola di DNA, sia dalla specifica sequenza dei 
nucleotidi. Questo processo può essere utilizzato per analizzare taluni aspetti del DNA. 
Poiché l’appaiamento citosina/guanina è più forte di quello adenina/timina, la quantità 
di CG in un genoma può essere stimata misurando la temperatura di melting di tale 
genoma (risulterà più alta, a parità di lunghezza, in quei DNA dove CG siano 
abbondanti). 
 
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Figura 2 - Struttura del DNA  
 
1.1.2 LE VIE DELL’INFORMAZIONE 
L’unità fondamentale dell’informazione negli organismi viventi è il gene; una specifica 
sequenza di DNA che contiene le informazioni in grado di influire sulle caratteristiche 
del fenotipo dell'organismo. Le molecole di DNA che contengono i geni cellulari, sono 
organizzate in strutture chiamate cromosomi. L’insieme del DNA genico si chiama 
genoma cellulare. I processi principali dell’informazione genetica sono tre: 
1. REPLICAZIONE: copiatura del DNA parentale per formare molecole di DNA 
figlie, con sequenze nucleotidiche identiche. Il processo di duplicazione del 
DNA prima della divisione di una cellula è SEMICONSERVATIVO, ciascuna 
nuova molecola di DNA è composta da una catena neosintetizzata e da una 
catena vecchia.  
La replicazione avviene in zone specifiche del cromosoma ricche di A-T e consta delle 
seguenti fasi (vedi figura 3): 
a) Apertura doppia elica: l’enzima elicasi, si muove lungo il DNA, e separa le 
catene usando l’energia chimica fornita dall’ATP. Esso agisce rompendo i