Caratterizzazione strutturale e funzionale di un enzima fibrinogenolitico dal veleno del serpente Trimeresurus elegans

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primordiali semplici enzimi digestivi. L’impossibilità di masticare e 
l’esigenza di dover ingoiare per intero le prede hanno fatto sì che questi 
rettili sviluppassero un sistema di digestione extracorporeo, ovvero una 
soluzione molto simile ai succhi gastrici degli altri animali, che permettesse 
una parziale pre-digestione del cibo, in modo da rendere più agevole la 
digestione dello stomaco. Le funzioni digestive di questa “saliva” 
modificata, sono via via cambiate nel corso dell’evoluzione, diventando nel 
tempo sempre più efficaci nei confronti di una determinata preda.  
      Il veleno di serpente è una soluzione di sostanza proteica, residuo 
cellulare, materia grassa e sali di calcio, ammonio, cloruro di magnesio e 
fosfati; contiene, inoltre, emotossina e neurotossina. L’emotossina 
danneggia i vasi sanguigni e provoca un travaso di sangue nei tessuti,  
edema esteso e scolorimento delle parti molli; la  neurotossina attacca, 
invece, i centri nervosi causando paralisi. Altri componenti dei veleni sono: 
fattori che interagiscono con il sistema emostatico, l’emolisina, che provoca 
la dissoluzione dei globuli rossi, l’agglutinina che produce l’agglutinazione 
dei globuli rossi con i bianchi; altri fattori di intossicazione non meglio 
stabiliti.  
      I polipeptidi di natura enzimatica e non costituiscono circa il 90% del 
peso secco di un veleno; ciò spiega perché i veleni di serpente sono 
considerati la più ricca secrezione proteica prodotta dai Vertebrati. Le 
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proteine contenute nei veleni di serpente hanno diverse e molteplici attività 
enzimatiche; si ritrovano, infatti, fosfolipasi, fosfomonoesterasi, 
fosfodiesterasi, L-amminoacido ossidasi, acetilcolinesterasi, proteasi 
(enzimi della classe delle serine esterasi e metalloproteasi), 5’ nucleotidasi, 
ialuronidasi e NAD nucleosidasi (Stocker, 1990). Peptidi trovati nei veleni 
di serpente comprendono, inoltre, citotossine, miotossine, cardiotossine ed 
enzimi che interferiscono con l’aggregazione piastrinica.  
      Per il serpente il modo migliore per uccidere una preda è quello di 
causarle una paralisi respiratoria o di procurarle un blocco circolatorio. La 
somministrazione di veleno di serpente in animali solitamente produce un 
abbassamento repentino della pressione sanguigna che conduce alla morte 
per arresto cardiaco: così lo shock circolatorio, accompagnato anche da 
emorragie interne, è una delle cause più frequenti di morte in seguito ad un 
morso di serpente velenoso. L’iniezione di alte dosi di veleno conduce, 
spesso, anche ad una morte dovuta alla formazione di coaguli intravascolari 
e, quindi, a fenomeni di trombosi.  
      Le piccole dosi di veleno che solitamente vengono iniettate in un uomo, 
in caso di morso accidentale da parte di un serpente, spesso conducono a 
disturbi della coagulazione (sindrome da defibrinogenazione). I pazienti 
morsi da serpenti velenosi si trovano spesso  in un grave stato di 
defibrinogenazione con livelli di fibrinogeno vicini allo zero e la 
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conseguente impossibilità, da parte del  sistema emostatico, di arrestare le 
emorragie. Benché non sia la sola causa delle emorragie prodotte dal veleno 
di serpente, la sindrome da defibrinogenazione certamente aggrava il 
processo emorragico a carico dei vasi sanguigni, danneggiati, tra l’altro, da 
altri componenti presenti spesso nello stesso veleno. La comparsa di 
gonfiori ed edema in seguito ad un morso di serpente, è dovuta all’aumento 
della permeabilità dei vasi sanguigni  dovuta all’emotossina presente in 
questi veleni. 
      Un numero elevato di proteine presenti nei veleni di serpente agisce sul 
sistema emostatico dei Mammiferi. In particolare, tre gruppi di tali proteine 
presentano, tra l’altro, un potenziale interesse clinico e farmacologico: gli 
enzimi fibrinogenolitici (enzimi di tipo thrombin-like), enzimi fibrinolitici 
ed inibitori dell’aggregazione piastrinica.  
 
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1.2 La coagulazione del sangue 
      Normalmente tutte le emorragie, tranne le più imponenti, si fermano 
rapidamente attraverso una serie di processi sequenziali: tale fenomeno 
prende il nome di emostasi. In primo luogo, un trauma stimola le piastrine 
(cellule ematiche non pigmentate e prive di nucleo)  ad aderire ai vasi 
sanguigni danneggiati e poi ad associarsi tra di loro  così da formare una 
barriera in grado di fermare le emorragie minori. Le piastrine aggregate e il 
tessuto danneggiato iniziano, a questo punto, il processo di coagulazione 
vero e proprio. Il coagulo (o trombo) si forma  come risultato di una cascata 
biforcata di reazioni proteolitiche che richiedono la partecipazione di quasi 
20 diverse  glicoproteine plasmatiche. Il coagulo è costituito da una 
moltitudine di molecole di fibrina intrecciate in modo da formare una rete 
fibrosa insolubile. La fibrina deriva dalla proteina plasmatica solubile 
fibrinogeno attraverso una reazione proteolitica catalizzata dalla serina 
proteasi trombina. Il fibrinogeno costituisce il 2 - 3% delle proteine 
plasmatiche. Una molecola di fibrinogeno è costituita da tre paia di catene 
polipeptidiche non identiche ma omologhe, Aα  (di 610 residui), Bβ  (di 461 
residui) e γ  (di 411 residui), e da quattro oligosaccaridi di circa 2,5 kDa 
ciascuno, legati con un legame N-glicosidico due alla catena Aα e due a 
quella Ββ . A e B rappresentano i fibrinopeptidi N-terminali di 16 e 14 
residui amminoacidici rispettivamente che vengono rilasciati dalla molecola 
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di fibrinogeno per azione della trombina. Studi al microscopio elettronico e 
cristallografia ai raggi X a bassa risoluzione mostrano il fibrinogeno come 
una molecola allungata di  ~ 450 Å, costituita da due porzioni simmetriche 
con due strutture nodulari  a ciascuna estremità ed una al centro. Le sue sei 
catene polipeptidiche sono unite da 17 ponti disolfuro, 7 all’interno di 
ciascuna metà del dimero e 3 che legano questi due protomeri. La regione 
centrale di ogni protomero ha una struttura superavvolta di tre α -eliche, di 
cui le catene α , β  e γ  costituiscono ciascuna un componente. La trombina 
idrolizza specificamente il legame Arg-X che tiene uniti i fibrinopeptidi A e 
B  alla macromolecola di fibrinogeno. La molecola di fibrina che ne risulta 
si aggrega spontaneamente formando fibre che mostrano al microscopio 
elettronico una struttura striata che si ripete ogni 225 Å. Questa distanza 
regolare corrisponde esattamente alla metà della lunghezza di un monomero 
di fibrina, suggerendo una associazione dei monomeri di fibrina per file 
sfalsate di metà molecola. La rimozione dei fibrinopeptidi dal fibrinogeno 
da parte della trombina espone dei siti, altrimenti mascherati, che mediano 
l’associazione intermolecolare che porta alla formazione del coagulo. 
L’aggregazione del fibrinogeno è inibita, invece, da repulsioni tra gruppi 
che esibiscono la stessa carica. I fibrinopeptidi, infatti, hanno una elevata 
carica negativa, a tal punto che la regione centrale del fibrinogeno, dove essi 
risiedono, ha una carica di -8, mentre quella della stessa regione nella 
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fibrina è +5. I segmenti laterali del fibrinogeno hanno ciascuno una carica 
simile, -4, ma mantengono la stessa carica anche nella fibrina. La repulsione 
tra i segmenti del fibrinogeno con carica simile ne impedisce 
l’aggregazione, mentre l’attrazione tra la porzione centrale e i segmenti 
laterali nella fibrina ne promuove l’associazione specifica. Tale è il 
meccanismo di formazione del cosiddetto coagulo morbido che, come 
indica il nome, è piuttosto fragile. Esso, però, è rapidamente trasformato in 
un coagulo duro, più stabile, dal legame covalente tra molecole di fibrina 
vicine, ad opera di una reazione catalizzata dal fattore stabilizzante la 
fibrina (FSF o XIIIa).  Il fattore XIIIa deriva dal fattore XIII per azione 
diretta della trombina che provoca l’idrolisi specifica di un legame Arg-Gly 
con il conseguente rilascio di un propeptide di 37 amminoacidi. Il fattore 
XIIIa è una transglutaminasi che forma legami isopeptidici tra un residuo di 
glutammina su una catena γ  e un residuo di lisina su un'altra. Le catene α  
sono collegate tra di loro in maniera analoga ma ad un ritmo più lento 
      I coaguli rappresentano, tuttavia, solo rimedi provvisori, che devono 
essere eliminati con il progredire della rimarginazione della ferita. E’, 
inoltre, indispensabile l’eliminazione di un coagulo che si sia 
inopportunamente formato o liberato, correndo libero nel sistema 
circolatorio. La fibrina è la molecola designata ad essere facilmente 
idrolizza in un processo chiamato fibrinolisi. L’agente idrolitico è una 
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serina proteasi plasmatica chiamata plasmina, un enzima che digerisce 
specificamente il segmento a tripla elica della fibrina.  
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1.3     Trombina e proteasi a serina 
 
      La trombina è una proteasi di tipo serinico che catalizza molteplici 
reazioni nel corso della coagulazione del sangue, agendo, tra l'altro, come 
potente attivatore dell'aggregazione piastrinica. Essa è costituita da due 
catene polipeptidiche legate da un ponte disolfuro: una catena A di 49 
residui amminoacidici e una B di 259. La catena B della trombina è 
omologa alla serina proteasi tripsina ma agisce in modo più selettivo: 
idrolizza solo particolari legami Arg-Gly di certe proteine. La trombina è 
sintetizzata come uno zimogeno di 582 residui, la protrombina (II), che è 
attivato da due reazioni catalizzate dal fattore di Stuart (X), a sua volta 
prodotto nel passaggio precedente della cascata proteolitica. La trombina 
idrolizza specificamente i legami Arg-Gly nelle catene Aα  e Bβ  del 
fibrinogeno provocando il rilascio dei fibrinopeptidi A e B.  
      Le serina proteasi costituiscono una classe molto importante di enzimi 
proteolitici  tra cui la tripsina (enzima digestivo di origine pancreatica), la 
chimotripsina (di origine e funzioni analoghe alla tripsina), l’elastasi, la 
plasmina (che opera la dissoluzione dei coaguli), la callicreina (che é 
implicata nel controllo del flusso ematico). Questi enzimi sono così 
chiamati  per il fatto che hanno un meccanismo catalitico comune basato su 
di un residuo di serina particolarmente reattivo ed essenziale per la loro 
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attività enzimatica. La chimotripsina, la tripsina e l’elastasi sono enzimi 
digestivi che vengono sintetizzati nel  pancreas e secreti attraverso il 
duodeno. Tutti e tre gli enzimi catalizzano l’idrolisi di legami peptidici 
(amidici), ma con diversa specificità per le catene laterali dei residui che 
affiancano il legame peptidico suscettibile. Il modo più semplice per 
stabilire la presenza di una serina attiva in una serina proteasi è la reazione 
con il diisopropilfosfofluoruro (DIPF) che inattiva irreversibilmente 
l’enzima. I residui cataliticamente essenziali in una serina proteasi sono, 
oltre alla serina, un residuo di acido aspartico ed uno di istidina. Questi tre 
residui formano una costellazione collegata da legami ad idrogeno chiamata 
triade catalitica. Il meccanismo catalitico, quindi, di tutte le serina proteasi 
è lo stesso e si basa sull’azione della triade catalitica, mentre la specificità è 
dettata, invece, dalle singole caratteristiche strutturali.