Caratterizzazione strutturale del Lipopolisaccaride isolato da mutanti di Burkholderia cenocepacia

2 
 
1.1  I BATTERI E  LA  LORO CLASSIFICAZIONE 
I batteri sono microorganismi unicellulari procarioti che presentano, di solito, delle 
dimensioni dell’ordine del micrometro. La loro classificazione prende in esame vari aspetti 
che tengono conto del dominio di appartenenza, della forma (bacilli, cocci, vibrioni, spirilli 
e spirochete), della resistenza  in condizioni estreme di temperatura (batteri psicrofili, 
mesofili e termofili) e delle modalità di interazione con un organismo e degli effetti che 
può produrre su di esso (batteri commensali e batteri patogeni). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
                                                                                  
      
 
 
                            Fig.1.1 Classificazione dei batteri in base a caratteristiche morfologiche 
 
I batteri possono essere, inoltre, classificati come Gram-positivi (+) o Gram negativi (-), in 
funzione  della risposta che essi forniscono al saggio colorimetrico, ideato dal medico 
danese Hans Gram. I batteri che sono in grado di trattenere il colorante vengono classificati 
come Gram (+), mentre quelli che perdono la colorazione vengono definiti Gram (-). La 
differenza nella capacità di trattenere il colorante basico è data dalla quantità di 
peptidoglicano (o mureina) contenuta nella parete cellulare: i gram-positivi, infatti, 
presentano una maggiore quantità di peptidoglicano rispetto ai gram-negativi. Questi ultimi 
sono dotati, quindi,  di una parete più sottile che non permette loro di trattenere il 
colorante, in seguito alla decolorazione prevista dal saggio colorimetrico. Da un punto di
3 
vista operativo la coltura batterica viene trattata con un colorante basico idrofilo (il più 
utilizzato è il cristal violetto), cui segue un lavaggio con il liquido di Lugol, una soluzione 
di iodio e ioduro di potassio, che reagisce con il colorante basico formando un composto 
liposolubile, che si lascia agire per circa 1 minuto. Successivamente il materiale organico 
viene lavato con una soluzione decolorante (alcool etilico o simili) e infine con acqua. In 
seguito a tale operazione, si osserva che batteri Gram (+) hanno trattenuto il colorante 
basico (viola), poiché l'alcool non ha danneggiato a sufficienza la spessa parete cellulare 
(idrofila) che non permette al colorante di passare mentre i Gram (-) sono grigiastri, privi 
di colorazione, in quanto l'alcool ha sciolto i lipidi della membrana esterna e danneggiato 
la sottile parete cellulare che non è più in grado di trattenere il complesso cristal violetto-
ioduro (liposolubile). Per far risaltare meglio la differenza  tra le due classi di batteri, si 
colora il materiale con un colorante di contrasto che è in genere safranina, conferendo una 
classica colorazione rossa alle cellule o eosina (colorazione rosa). Queste sostanze possono 
penetrare solo in cellule decolorate poiché, anche se solo modestamente idrofile, sono in 
grado di attraversare la parete cellulare grazie alle loro ridotte dimensioni. 
[1] 
 
                       
                                          Fig. 1.2  Colorazione di Gram per batteri Gram (+) e Gram (-)
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1.2  MEMBRANA CELLULARE  
La membrana cellulare, detta anche membrana plasmatica, è un sottile rivestimento con 
spessore di 5 nm che delimita la cellula in tutti gli organismi viventi, la separa 
dall'ambiente esterno, regolandone gli scambi. Essa è formata prevalentemente da 
fosfolipidi, e presenta una struttura a doppio strato. Negli organismi procarioti è ricoperta 
da un rivestimento protettivo chiamato parete cellulare, assente invece negli eucarioti. La 
membrana cellulare presiede all'omeostasi cellulare (caratteristica peculiare degli 
organismi viventi, fondamentale per la sopravvivenza) grazie alla sua permeabilità 
selettiva.  
Per la sua posizione di interfaccia, la membrana plasmatica svolge tre funzioni essenziali: 
1. svolge la funzione di filtro selettivo, cioè consente il  passaggio preferenziale di 
alcune sostanze, necessarie per la sopravvivenza della cellula come acqua, gas (O
2
, 
CO
2
) e piccole molecole liposolubili (prive di carica), come ammoniaca, urea, 
etanolo e glicerolo, mentre specifiche proteine di trasporto assicurano il passaggio 
di ioni e molecole idrosolubili (elettricamente cariche). Il passaggio attraverso la 
componente lipidica della membrana avviene per semplice diffusione passiva, 
senza consumo di energia (ATP) 
[1]
; 
2. permette alle strutture, presenti nello spazio intra- ed extracellulare, di comunicare 
tra di loro e di scambiare  informazioni. 
3. partecipa a funzioni complesse quali esocitosi (secrezione), endocitosi (ingestione 
di sostanze esterne mediante la formazione di vescicole), adesione e movimento 
cellulare ameboide (es. leucociti). 
1.3 PARETE CELLULARE 
La parete cellulare dei procarioti presenta delle caratteristiche strutturali che non trovano 
alcun riscontro in quelle degli altri esseri viventi. Il componente principale è il 
peptidoglicano o mureina che conferisce resistenza e forma alla cellula: nei Gram (+) si 
può osservare un certo grado di disomogeneità a livello strutturale, in quanto il suo 
spessore può variare  tra i 150 e gli 800 Å, a seconda della specie che si sta prendendo in 
esame; nei Gram (-), si osserva, invece, un’organizzazione della parete cellulare molto più 
omogenea, in quanto non ci sono grosse variazioni nello spessore, le cui dimensioni sono 
comprese tra gli 80 e i 100 Å.
5 
 I costituenti principali del peptidoglicano sono due amminozuccheri acetilati, l’N-acetil-
glucosammina (NAG) e l’acido N-acetilmurammico (NAM), uniti tra loro da un legame β-
(1→4) glicosidico che formano catene di lunghezza variabile, compreso in un range di 
valori che va  da 10 a 80 unità disaccaridiche. Le unità glicidiche sono legate tra loro da un 
tetrapeptide costituito da residui di D-Alanina, L-Alanina, acido D-glutammico e acido 
meso-diammino pimelico (nei Gram negativi) o da L-Lisina (nei Gram positivi). Queste 
unità tetrapeptidiche sono  interconnesse mediante due possibili legami: un legame diretto 
che impegna l’acido meso-diammino pimelico della posizione 3 di una catena peptidica e 
la D-Alanina della posizione 4 di una catena adiacente (tipico dei Gram negativi e dei 
bacilli Gram positivi) o un legame mediato, in cui un ponte pentaglicinico presente in 
corrispondenza della L-lisina in posizione 3, forma un legame con un’unità di D-Alanina 
della posizione 4 presente sulla catena adiacente (tipico dei Gram positivi).
 [2]
  
 
                          
   
    
(a)                                                                      (b) 
 
               Fig.1.3  Differenze strutturali tra (a) Gram (+) e (b) Gram (-) a livello del peptidoglicano.
6 
1.4  MEMBRANA ESTERNA  
La presenza di una membrana esterna nei Gram negativi è un altro elemento di 
differenziazione tra le due categorie di batteri discusse nel precedente paragrafo. Dal punto 
di vista funzionale, essa impedisce il passaggio di diverse sostanze che possono, in qualche 
modo, minare alla sopravvivenza della cellula. A differenza di quanto accade sulla 
membrana cellulare, il trasporto delle sostanze necessarie per la sopravvivenza delle cellule 
avviene per semplice diffusione. Si trovano poi strutture come i lipopolisaccaridi (LPS), 
costituiti da una regione lipidica, che rappresenta una specie di ancoraggio alla membrana, 
e da una regione saccaridica che sporge sul lato esterno della stessa . 
[3]
 
 
                  
                                       Fig 1.4   Struttura della membrana dei batteri Gram(-) 
 
 
1.5  I LIPOPOLISACCARIDI 
I lipopolisaccaridi sono molecole anfifiliche, localizzate sulla membrana esterna dei batteri 
Gram(-) e rappresentano il 3-5% del peso totale della cellula batterica. Essi constano di una 
componente glicolipidica che permette l’ancoraggio alla membrana e una componente 
glucidica di natura oligo- o polisaccaridica che, protesa verso l’esterno, permette al batterio 
l’adesione e l’ancoraggio sulle cellule dell’organismo ospite fungendo in caso di infezione 
da determinante antigenico. Da un punto di vista strutturale, gli LPS sono costituiti da tre
7 
domini chimicamente, biologicamente e geneticamente differenti : lipide A, core 
oligosaccaridico e O-chain 
[4]
. 
 
 
                                           Fig.1.5  Struttura dell’LPS 
 
LIPIDE A 
Rappresenta la componente più vicina alla membrana ed è ancorata sulla sua superficie; 
inoltre costituisce la porzione più conservata tra i batteri appartenenti alla stessa specie. 
E’generalmente formata da un’unità disaccaridica, composta da due residui di 
glucosammina (1 6) legate, acilata sulle posizioni 2 e 3 e fosforilata sulle posizioni 1 e 
4’. Le catene di acidi grassi,dette primarie, costituite da 10-22 atomi di carbonio, 
presentano un gruppo ossidrilico sulla posizione 3 sul quale si possono legare altre catene 
di acidi grassi mediante legame estereo, classificando quest’ultime come catene 
secondarie. Sebbene lo schema qui presentato sia presente nella quasi totalità dei batteri 
Gram (-), in taluni casi è possibile rilevare delle differenze strutturali a livello del backbone 
disaccaridico, delle catene di acidi grassi o dei gruppi fosfato che possono essere assenti o 
presentare ulteriori sostituenti, i quali possono giocare un ruolo determinante nell’attività 
endotossica del batterio.
[4]
 
 
 
Lipid 
A 
Cor
e 
  
  
 
 
O-side-
chain 
Lipide A 
AA 
Core 
  
  
 
 
O-side-chain
8 
   
 
                                                   Fig 1.6 Lipide A di E.coli 
 
 
CORE OLIGOSACCARIDICO 
Il core rappresenta il dominio centrale dell’LPS, può contenere fino ad un massimo di 15 
unità saccaridiche ed è legato covalentemente al lipide A. Il core è suddiviso in due 
regioni: il core interno e il core esterno. Il core interno è tipicamente costituito da 1 o 2  
residui di Kdo (acido 2-  cheto-3-deossi-D-manno-ottulosonico), zucchero peculiare per i 
batteri Gram negativi, legati all’unita di  glucosammina non riducente (GlcN II)  attraverso 
un legame -(2 6) glicosidico  e tre residui di eptosi  connessi al primo residuo di  Kdo 
mediante un legame -(1 5) glicosidico. Il core esterno, invece, è composto 
principalmente da esosi, ma può anche contenere acidi uronici ed amminozuccheri. 
Possono essere presenti, infine, anche residui di natura non zuccherina, come esteri, eteri, o 
ammidi che costituiscono importanti fattori di variabilità. In alcuni specie batteriche, come 
Acinetobacter e Burkholderia, i LPS presentano un residuo zuccherino poco comune, 
simile al Kdo: l’acido D-glicero-D-talo-2- ottulpiranosonico, meglio noto come Ko.
9 
O-CHAIN 
L’O-specific Chain rappresenta la porzione polisaccaridica ed è caratterizzata da un elevato 
grado di variabilità strutturale. Essa sporge all’esterno della membrana ed è costituita da un 
eteropolimero, comprendente 20-50 unità ripetitive oligosaccaridiche ciascuna delle quali 
può contenere fino ad un massimo di 8 residui monosaccaridici, recanti, in molte 
situazioni, anche sostituenti di natura non zuccherina. I batteri che presentano nell’LPS 
questa porzione mostrano una tipica morfologia  Smooth (liscio e in questo caso si parla di 
S-LPS) mentre batteri che ne sono privi vengono classificati come Rough (rugoso, R-LPS); 
in questo caso, tale struttura può essere classificata anche come lipooligosaccaride (LOS). 
Oltre a svolgere  funzioni di adesione cellulare, l’O-chain riveste un ruolo importante come 
determinante antigenico, andando inoltre a coprire delle porzioni fondamentali coinvolte 
nei meccanismi di patogenesi, altrimenti visibili dal nostro sistema immunitario. 
1.6  IL RICONOSCIMENTO DELL’LPS NEGLI ESSERI VIVENTI 
1.6.1 IMMUNITA’ INNATA E IMMUNITA’ ACQUISITA 
Il sistema immunitario è molto complesso ed ha la funzione di proteggere l'organismo 
dall’aggressione degli agenti patogeni. E’ presente in tutti i vertebrati  ed è capace di 
rispondere a tutte le sostanze estranee all'organismo, riconoscendo in modo altamente 
specifico, milioni di antigeni diversi che possono presentare anche piccolissime variazioni 
in termini di composizione. Per svolgere queste funzioni, il sistema immunitario deve 
essere, in ogni momento, in grado di riconoscere ciò che è proprio dell'organismo (self) da 
ciò che non lo è (non self).Le modalità di riconoscimento delle specie patogene sono 
affidate a due aree del sistema immunitario: l’immunità aspecifica o innata, che 
riconosce un generico segnale di pericolo, mettendo in modo tutta una serie di meccanismi, 
volti a limitare lo sviluppo dell’infezione, dando così il tempo all’area del sistema 
immunitario adattativo di sviluppare una risposta infiammatoria adeguata. 
I componenti principali dell’immunità innata sono:  
(1) le barriere fisico/chimiche dell'organismo, quali gli epiteli e le sostanze ad 
azione antimicrobica da essi prodotte;  
(2) le cellule ad attività fagocitica (neutrofili, macrofagi) e le cellule ad 
attività citotossica naturale (natural killer, NK);