Caratterizzazione scheletrica di un modello animale di mucopolisaccaridosi di tipo VI (MPS VI)

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Durante il mio lavoro di tesi, svolto nel laboratorio del Prof Alberto 
Auricchio presso l’istituto TIGEM, mi sono occupata della caratterizzazione 
delle anomalie scheletriche presenti in modelli animali affetti dalla malattia, 
da accumulo lisosomiale, Mucopolisaccaridosi di tipo VI (MPS VI), anche 
nota come sindrome di Maroteaux-Lamy; allo scopo di comprenderne le basi 
patogenetiche e di sviluppare future strategie terapeutiche. 
 
I lisosomi e gli enzimi lisosomiali 
Il lisosoma è l’organello che costituisce il “sistema digerente” della cellula 
in quanto responsabile della degradazione di macromolecole sia endogene 
che ingerite dalla cellula attraverso endocitosi, fagocitosi o prodotte 
attraverso autofagia. La degradazione avviene per mezzo di enzimi idrolitici, 
anche detti idrolasi acide, contenuti nell'organello in grado di degradare 
proteine, lipidi e carboidrati nei loro costituenti elementari e permettendone 
la successiva riutilizzazione o espulsione dalla cellula. Gli enzimi litici, 
prodotti nel reticolo endoplasmatico vengono fosforilati a livello di specifici 
residui oligosaccaridici (residui di mannosio) sul versante cis dell'apparato 
del Golgi ad opera di una fosfotransferasi che forma così residui di 
mannosio-6-fosfato(M6P). Gli enzimi così modificati vengono riconosciuti, 
sempre all’interno del Golgi, dai recettori del M6P e diretti specificamente 
tramite vescicole di trasporto verso gli endosomi tardivi o pre-lisosomi così
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definiti in quanto hanno un pH intermedio tra quello dell’ambiente 
citosolico, che è circa 7.2, e quello acido dei lisosomi, pari a 5 (Fig. 1). 
 
Fig. 1. Sintesi e destino degli enzimi lisosomiali: gli enzimi lisosomiali sintetizzati nel 
reticolo endoplasmatico ruvido (RER), vengono indirizzati all’apparato del Golgi dove, 
previa fosforilazione, sono riconosciuti dai recettori del Mannosio 6 fosfato(M6P) e 
veicolati ai pre-lisosomi. 
Quando le nuove vescicole, contenenti nuovi enzimi, si fondono al pre-
lisosoma, il suo pH acido consente il distacco degli enzimi lisosomiali dai 
recettori del M6P e la loro attivazione. Infine, la conversione del pre-
lisosoma a lisosoma prevede un ulteriore abbassamento del pH a 5.0-5.5, 
necessario per l’attivazione delle idrolasi acide. Dopo aver rilasciato gli 
enzimi legati, i recettori del M6P sono recuperati in vescicole di trasporto 
che gemmano dagli endosomi tardivi e ritornano alla membrana del reticolo 
trans del Golgi per essere riutilizzati. Non tutti gli enzimi lisosomiali 
raggiungono i lisosomi; una parte di essi infatti viene secreta nel fluido 
extracellulare tramite la via classica di secrezione. Alcuni recettori del M6P,
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però, sono anch’essi trasportati alla membrana cellulare dove svolgono un 
azione di recupero delle idrolasi lisosomiali erroneamente secrete 
riportandole, tramite endocitosi mediata da recettore, ai lisosomi, passando 
per gli endosomi precoci e tardivi. Le idrolasi lisosomiali vengono 
classificate in proteasi, lipasi, deossiribonucleasi, ribonucleasi, glicosidasi, 
fosfolipasi, arilsolfatasi e fosfatasi acide. Il non corretto funzionamento di 
uno o più enzimi lisosomiali è causa di patologie dette “malattie da 
accumulo lisosomiale” anche note come LSD, dall’inglese “Lysosomal 
Storage Disease”, caratterizzate, come anche il nome suggerisce, 
dall’accumulo, nei lisosomi, di materiale parzialmente o completamente non 
degradato.  
Le malattie da accumulo lisosomiale 
Nell’uomo le LSD comprendono più di quaranta disordini genetici 
determinati, come precedentemente detto, da difetti nella funzione di 
specifici enzimi lisosomiali 
1
. Singolarmente, queste malattie sono 
considerate estremamente rare ma, se raggruppate le LSD hanno 
un‘incidenza approssimativa di 1 su 7000/8000 nati vivi. Queste patologie 
sono classificate, sulla base del tipo di materiale che si accumula nei 
lisosomi, nelle seguenti categorie:
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°disordini dell’immagazzinamento lipidico, come le malattie di Gaucher 
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 e 
di Niemann-Pick 
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, caratterizzate la prima dall’accumulo di glucocerebroside 
(GC), e la seconda da accumulo di sfingomielina; 
°gangliosidosi, tra cui la malattia di Tay-Sachs 
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 che provoca l'accumulo del 
ganglioside GM2 nel cervello; 
°mucopolisaccaridosi, dette MPS, quali ad es. la sindrome di Hunter 
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 e la 
malattia di Hurler
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 con accumulo di glicosaminoglicani (GAG);
 
 
°mucolipidosi
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, in cui la causa delle malattie è un accumulo di carboidrati o 
di lipidi nelle cellule; 
 In particolare, le mucopolisaccaridosi sono causate da un difetto in uno 
degli enzimi che catalizza la degradazione dei GAG, componenti naturali 
della matrice extracellulare, normalmente sintetizzati e degradati da tutte le 
cellule. I GAG non degradati o parzialmente degradati sono immagazzinati 
nei lisosomi e/o escreti nelle urine. In funzione dell’enzima difettoso, il 
catabolismo dei diversi GAG, quali il dermatan solfato, eparan solfato, 
cheratan solfato o condroitin solfato, può essere bloccato singolarmente o in 
combinazione. L’accumulo di GAG nei lisosomi interferisce con il normale 
funzionamento cellulare, causando disfunzioni a carico di tessuti ed organi. 
Ad oggi, sono noti 11 enzimi conosciuti i cui deficit causano nove distinte 
mucopolisaccaridosi, indicate con numeri crescenti (da MPS I ad MPS IX).
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Le diverse mucopolisaccaridosi presentano simili sintomi e segni clinici. 
Hanno un decorso cronico e progressivo ed un interessamento 
multisistemico con organomegalia, anomalie scheletriche che nell’insieme 
sono denominate “disostosi multipla”, anomalie facciali e ritardo di crescita. 
Generalmente sono affetti l’udito, la vista, l’apparato respiratorio, la 
funzione cardiovascolare e la motilità articolare 
1, 8
. Nonostante tali 
similitudini cliniche, le MPS presentano un vasto spettro di gravità clinica 
con enorme variabilità del fenotipo sia tra pazienti con diversi tipi di MPS 
che con la stessa patologia 
8
. Ad esempio ritardo mentale grave si riscontra 
in pazienti con MPS IH (sindrome di Hurler), o in forme gravi di MPS II 
(sindrome di Hunter), od ancora in alcuni sottotipi di MPS III, mentre in altri 
tipi, come l’MPS VI, l’intelligenza può essere normale. Dal punto di vista 
molecolare molte MPS sono caratterizzate da mutazioni nelle solfatasi, come 
l’MPS II o VI. Le solfatasi costituiscono una famiglia di proteine (Fig. 2) 
coinvolte nel taglio degli esteri del solfato da molecole come GAG, 
solfolipidi o steroidi solfati. Esse sono caratterizzate da una comune 
modificazione posttranslazionale operata dall’enzima SUMF1(enzima 
modificante le solfatasi 1) il quale converte, nel sito catalitico delle solfatasi, 
un residuo di cisteina in formilglicina 
9
. Tale modificazione avviene nel 
reticolo endoplasmatico ed è fondamentale per l’attivazione catalitica di 
tutte le solfatasi; il deficit di SUMF1 determina una malattia da accumulo 
lisosomiale molto grave nota come Deficit Multiplo di Solfatasi (MSD,
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dall’inglese “Multiple Sulfatase Deficiency”) 
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dovuta alla mancata attività 
di tutte le solfatasi contemporaneamente. Esperimenti in vitro hanno 
dimostrato che l’over-espressione di SUMF1 aumenta l’attività di solfatasi 
over-espresse in cellule in coltura 
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, suggerendo che SUMF1 è un fattore 
limitante per l’attivazione delle solfatasi. Alcune solfatasi sono contenute nel 
compartimento lisosomiale (Fig. 2) e sono deputate alla degradazione dei 
mucopolisaccaridi. Ad esempio, deficit nell’attività dell’enzima n-
acetilgalattosamina-4-solfatasi (arilsolfatasiB, ArsB) causa la sindrome di 
Maroteaux-Lamy (MPS VI).  
 
Fig. 2. Localizzazione delle solfatasi e malattie associate. Delle diciassette solfatasi 
note, sei sono localizate nei lisosomi (in viola), sette nei compartimenti reticolari (RE) e 
del Golgi (in rosso), due sulla membrana plasmatica (in verde), mentre le restanti due 
sono a localizazione ignota (in nero). Sono note otto malattie ognuna delle quali è 
associata al deficit di una singola solfatasi. Di queste malattie, sei sono 
mucopolisaccaridosi (MPS) e sono dovute al deficit di enzimi lisosomiali per cui sono 
classificate come malattie da accumulo lisosomiale (LSD).
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La Mucopolisaccaridosi VI 
La MPS VI è una malattia da accumulo lisosomiale dovuta a mutazioni nel 
gene che codifica l’ArsB, enzima lisosomiale coinvolto nella degradazione 
del glicosamminoglicano dermatan solfato (DS). Il gene che codifica per l’ 
n-acetilgalattosamina 4-solfatasi è composto da otto esoni 
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 ed è localizzato 
sul cromosoma 5q13-q14 
11
. Sono state identificate più di trenta mutazioni 
dell’ArsB in pazienti affetti da MPS VI, la maggior parte delle quali in 
singole famiglie. Sono state descritte tre forme della malattia: grave, 
intermedia, lieve 
12
. Le mutazioni che negli omozigoti danno origine alla 
forma grave della sindrome di Maroteaux-Lamy includono il frameshift 
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e le mutazioni non senso 
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associate ad abolizione o comunque forte 
riduzione dell’attività enzimatica, mentre mutazioni missenso possono dare 
origine alla forma grave, intermedia o lieve della malattia 
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, a seconda 
dell’attività residua dell’enzima mutato. La correlazione genotipo/fenotipo 
per le mutazioni missenso è difficile e non permette di fare precisioni 
prognostiche 
1
.
 
Per quanto concerne la diagnosi della MPS VI, così come 
delle altre MPS, la ricerca dei glicosaminoglicani urinari è stato il primo 
metodo disponibile e rimane tuttora utile come test iniziale; sebbene 
permetta di identificare il tipo di mucopolisaccaridosi, non consente di 
discriminare però tra i vari sottogruppi, per cui, la diagnosi definitiva è 
stabilita mediante il dosaggio dell’attività enzimatica 
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. In genere, per il 
dosaggio, vengono frequentemente usati il siero, i leucociti ed i fibroblasti