Bioprotezione di prodotti da forno mediante l’utilizzo di batteri lattici con attività antifungina

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1. Introduzione 
 
I microrganismi hanno un ruolo fondamentale nelle trasformazioni alimentari perché sono in 
grado, con la loro attività metabolica, di modificare notevolmente le caratteristiche chimico-
fisiche e organolettiche delle materie prime utilizzate. Nei processi industriali di produzione 
degli alimenti, i microrganismi possono essere coinvolti direttamente come agenti di 
trasformazione nelle fermentazioni, indirettamente come alteranti (che rendono l’alimento 
inaccettabile dal punto di vista sensoriale) o patogeni (che possono determinare l’insorgenza di 
patologie umane dopo l’ingestione del prodotto). 
La microbiologia degli alimenti studia i microrganismi che sono presenti naturalmente, introdotti 
intenzionalmente o contaminanti dei prodotti alimentari. Questi microrganismi possono essere 
desiderati perché con la loro presenza ed attività biochimica possono trasformare materie prime 
in prodotti finiti con una shelf life (o vita commerciale) più estesa nel tempo e con caratteristiche 
organolettiche apprezzate dal consumatore finale. Esempi di prodotti di questo genere sono 
costituiti da formaggi, salumi, birra e vino (Cocolin e Comi, 2007). 
L’abilità dei singoli gruppi di microrganismi di sopravvivere e duplicare in un determinato 
ecosistema alimentare in condizioni dinamiche determinerà la microflora dell’alimento, definito 
come il consorzio di microrganismi presenti in un determinato ambiente. 
Parametri intrinseci (che sono propri dell’alimento in sé) ed estrinseci (identificati nelle 
caratteristiche dell’ambiente circostante, influenzanti sia l’alimento stesso sia i microrganismi in 
esso contenuti) possono essere manipolati al fine di limitare la crescita e l’attività microbica ed 
in questo modo conservare gli alimenti (Cocolin e Comi, 2007). 
Tra i parametri intrinseci si possono elencare: 
 il contenuto di acqua: è definito dall’attività dell’acqua (A
w
), che descrive le molecole di 
acqua che sono disponibili per il microrganismo in un ecosistema alimentare. I 
microrganismi possiedono esigenze diverse riguardo all’attività dell’acqua, ma in 
generale, dato che tutte le reazioni biologiche necessitano di un ambiente acquoso, ci si 
aspetta che una riduzione del valore di A
w
 abbia un immediato effetto sul metabolismo e 
sullo stato fisiologico generale della cellula. 
 il pH: la maggior parte dei microrganismi d’interesse alimentare cresce a valori di pH 
vicini alla neutralità. Negli alimenti, i valori di pH variano da neutro ad acido: l’acidità 
può essere inerente alla tipologia di alimento, oppure può essere il risultato di attività 
microbica (è il caso dei prodotti fermentati). Con le fermentazioni alimentari, vengono 
prodotti acidi organici deboli (pK
a
 elevata) che possono diffondere attraverso la
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membrana cellulare, dissociarsi all’interno della cellula e di conseguenza diminuire il pH 
intracellulare. Ciò è importante per proteggere gli alimenti da microrganismi alteranti e 
patogeni. 
 i composti naturalmente presenti che possono facilitare o inibire la crescita microbica: ciò 
dipende dalla matrice alimentare presa in considerazione. 
 il potenziale ossidoriduttivo: è in funzione della capacità di crescita dei microrganismi in 
presenza di ossigeno. Le differenze tra i microrganismi sono basate sul fatto che 
l’ossigeno può generare composti tossici a livello cellulare (intermedi reattivi 
dell’ossigeno, detti ROS): esistono gruppi di microrganismi dotati di enzimi 
detossificanti (aerobi, anaerobi facoltativi), mentre altri gruppi non li possiedono 
(anaerobi stretti). 
 la presenza di nutrienti: i microrganismi per proliferare hanno bisogno di nutrienti. In 
particolare, in ogni alimento che funga da substrato per la crescita microbica, deve essere 
sempre presente una fonte di carbonio ed energia (zuccheri, amminoacidi e alcoli), una 
fonte di azoto (amminoacidi e nucleotidi), minerali, vitamine e fattori di crescita. 
Tra i parametri estrinseci si ritrovano: 
 la temperatura: è il parametro più importante che permette di suddividere i microrganismi 
in diversi gruppi in base alla loro capacità di crescere in specifici intervalli di 
temperatura. Il cambiamento della temperatura durante il processo produttivo 
(pastorizzazione e sterilizzazione) e durante la conservazione (refrigerazione e 
congelamento) è una tecnica molto utilizzata per salvaguardare la qualità degli alimenti. 
 l’atmosfera circondante l’alimento: tale condizione deve essere controllata in base alle 
caratteristiche del microrganismo e dell’alimento stesso, in modo da garantire la migliore 
produzione e conservazione. Esistono diversi metodi di confezionamento in atmosfera 
modificata impiegati per modificare l’ambiente gassoso, utilizzando l’anidride carbonica 
come gas preservante (Jay et al., 2009). 
 
 1.1 La bioprotezione 
 
Le tossinfezioni alimentari rappresentano un crescente problema per la salute pubblica a livello 
internazionale. Sono conosciute attualmente oltre 250 malattie trasmesse attraverso gli alimenti, 
causate da diversi agenti patogeni, come batteri, muffe, virus e parassiti. La conservazione 
biologica degli alimenti attraverso l'impiego di colture starter e colture di batteri produttori di 
batteriocine in combinazione con altre tecnologie di conservazione, può rappresentare per le
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industrie alimentari un modo efficace per poter fronteggiare le nuove tendenze alimentari 
espresse dai consumatori e allo stesso tempo garantire la dovuta qualità e sicurezza dei prodotti 
commercializzati. Naturalmente il successo di questi sistemi di produzione e conservazione è 
strettamente associato ai continui sviluppi delle conoscenze che emergono dalla ricerca applicata 
ad ogni specifico sistema alimentare. 
Nell'ultimo decennio si è definito un nuovo approccio alla stabilizzazione degli alimenti, 
chiamato bioprotezione (o bioconservazione), che si basa sull'antagonismo dimostrato da alcuni 
microrganismi nei confronti di altri; in particolare i batteri lattici rappresentano un gruppo di 
microrganismi che può svolgere un ruolo protettivo contrastando lo sviluppo di microrganismi 
patogeni (Cocolin et al., 2010). I batteri lattici, infatti, sono spesso utilizzati come colture 
starter, in quanto, oltre a determinare (insieme ad altre famiglie di batteri) il flavour del 
prodotto, hanno un importante effetto protettivo, che si riflette anche in un prolungamento della 
shelf life. La fermentazione dei carboidrati presenti nella materia prima determina un 
abbassamento del pH in seguito alla produzione di acido lattico che disturba l'omeostasi del 
microrganismo patogeno e quindi la sua sopravvivenza. La richiesta da parte dei consumatori di 
alimenti sempre più sani e “naturali”, spinge i produttori ad abbandonare, dove possibile, gli 
agenti chimici. Come conseguenza l’interesse per agenti microbici “naturali” sta crescendo di 
anno in anno. I microrganismi, per loro stessa natura, sono in grado di attivare una serie di 
sistemi difensivi estremamente varia. Tra questi sistemi rientrano i classici antibiotici, svariati 
agenti litici, diversi prodotti del metabolismo batterico, varie tipologie di esotossine, e le 
batteriocine. Nell’ambito della conservazione e della qualità alimentare, lo studio sulle 
batteriocine prodotte dai batteri lattici assume un ruolo fondamentale (Cocolin et al., 2010). 
Queste sostanze sono in prevalenza di tipo proteico, biologicamente attive sintetizzate a livello 
ribosomiale ed eventualmente modificate post-traduzionalmente, in grado di esercitare attività 
battericida nei confronti di altre specie batteriche, ma non sul microrganismo produttore. Le 
batteriocine sono, infatti, capaci di inibire la crescita di microrganismi, in alcuni casi anche 
patogeni. Numerosi studi hanno descritto che queste molecole non sono attive contro 
microrganismi eucarioti, come lieviti o muffe (Batish et al., 1996; Daliè et al., 2009). 
 
Con il termine batteriocine, coniato nel 1953 da Jacob e collaboratori, vengono indicate quelle 
molecole proteiche di produzione batterica generate indifferentemente da Gram-positivi e da 
Gram-negativi e dotate di attività inibitoria nei confronti di ceppi batterici diversi dal ceppo 
produttore (Figura 1.1). Le batteriocine prodotte dai batteri Gram negativi sono generalmente 
proteine ad elevato peso molecolare che presentano un caratteristico dominio, specifico per
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l’adesione, la traslocazione o l’attività di killing della batteriocina stessa, mentre le batteriocine 
prodotte dai batteri Gram positivi sono generalmente peptidi cationici, di piccole dimensioni e 
termostabili, inizialmente sintetizzati come pre-peptidi e che, in seguito a fenomeni di scissione, 
si trasformano nelle molecole biologicamente attive. I geni che codificano per le batteriocine 
prodotte dai batteri Gram negativi risultano localizzati a livello plasmidico, mentre i geni che 
codificano per le batteriocine prodotte dai Gram positivi possono essere presenti sia a livello 
plasmidico che cromosomico, ed inoltre si localizzano specificamente in strutture multigene 
operone-simili; il corredo genetico deputato alla produzione delle batteriocine ad opera dei Gram 
positivi risulta anche estremamente più ampio rispetto a quello dei Gram negativi. Le 
batteriocine prodotte dai batteri Gram negativi si differenziano rispetto a quelle elaborate da 
microrganismi Gram positivi in quanto le prime agiscono mediante formazione di canali ionici a 
livello di membrana citoplasmatica e mostrano, una volta penetrate nella cellula sensibile/target, 
una spiccata attività nucleasica, mentre le seconde sono “membrana-attive”, ossia operano 
direttamente a livello di membrana. Lo spettro d’inibizione delle batteriocine prodotte dai Gram 
negativi è strettamente correlato alla specie produttrice, mentre le batteriocine prodotte dai Gram 
positivi si dimostrano attive non solo verso altri batteri Gram positivi ma, occasionalmente, 
anche verso microrganismi Gram negativi (Raffi e Ossiprandi, 2006). 
 
 
 
 
Figura 1.1: i batteri lattici possono produrre diversi composti antimicrobici, ma le batteriocine sono 
spesso i più potenti inibitori di batteri patogeni. Un produttore di batteriocine (in alto) può essere 
identificato dalle zone di inibizione prodotta in una capsula petri contenente cellule di batteri 
sensibili ad esse (Deegan et al., 2006)