Un progetto innovativo in questo campo è dunque la selezione di
organismi che grazie alla loro composizione biochimica possono avere
le più alte aspettative di successo.
Gli agenti chemioterapici convenzionali mostrano ancora gravi effetti
collaterali che ne limitano l’utilizzo, mentre agenti naturali sembrano
minimizzare il problema dell’alta tossicità.
Purtroppo, molti tumori non riescono ad andare incontro ad apoptosi
in risposta alla terapia anticancro quando sviluppano resistenza,
perciò, la scoperta di nuovi fattori con attività apoptotica su cellule
tumorali può avere importanti sviluppi clinici.
Capire gli eventi molecolari che regolano l’apoptosi è utile sia per
fornire nuove opportunità allo sviluppo di terapie, sia per sviluppare
manipolazioni strutturali di questi organismi e per migliorare le loro
proprietà anticancro. Infatti, molti farmaci anti-neoplastici agiscono
sulle cellule tumorali inducendo apoptosi.
L’apoptosi è un evento fisiologico delle cellule che, per mantenere
l’omeostasi dell’organismo, vanno incontro a morte cellulare
programmata e rappresenta senza dubbio un’emergente area di studio
e di conoscenza nella biologia cellulare e nella medicina come
dimostrato dall’interesse degli scienziati di tutti i Paesi e dalla vasta
quantità di pubblicazioni prodotta negli ultimi anni.
È stato chiaramente dimostrato che i composti bioattivi prodotti dalle
diatomee marine possono essere di enorme interesse per le
applicazioni biotecnologiche e mediche in particolare.
Da un punto di vista generale, il punto critico per la scoperta di nuovi
farmaci e della loro corretta applicazione è rappresentato dalla difficile
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collaborazione tra diverse discipline come l’ecologia marina, la
chimica e la patologia umana.
La recente scoperta (Miralto et al.1999) della stretta relazione tra il
cibo bentonico e la reversibilità sessuale in specie marine di crostacei
decapodi (H.inermis) e la scoperta che gli effetti prodotti sono
accompagnati da un selettivo processo apoptotico apre nuove strade
per lo sviluppo di potenti biotecnologie e fa luce sui fattori che sono
coinvolti in un processo cellulare così importante quale la morte
cellulare programmata.
Le biomolecole aventi applicazioni mediche sono largamente
distribuite negli organismi marini e c’è un rinnovato interesse
nell’ottenere estratti naturali e comprendere meglio la chimica dei
prodotti medici e degli alimenti.
Alcune diatomee planctoniche contengono fattori che influenzano
selettivamente la biologia di cellule neoplastiche e possono provocare
apoptosi in linee cellulari tumorali.
L’attività inibitoria sulla crescita cellulare di aldeidi estratti da
diatomee è stata testata in vitro su cellule neoplastiche umane.
Lo scopo della mia ricerca è quello di isolare, caratterizzare e
investigare l’attività biologica e il meccanismo d’azione di fattori
presenti nelle diatomee marine attraverso nuove tecnologie
biotecnologiche.
L’ingestione delle diatomee del genere Cocconeis induce lo sviluppo
in senso femminile del gamberetto Hippolite inermis che vive nel
habitat della Posidonia oceanica.
Questo è dovuto alla prematura distruzione della gonade maschile
attraverso un processo biologico ben noto: l’apoptosi e ciò avviene sia
7
in vivo che in laboratorio durante la prima fase di maturazione
postlarvale.
L’azione è specificatamente indotta da alcune diatomee ed è selettiva
per la gonade maschile e per la ghiandola androgena, provocando la
morte rapida delle cellule che sarebbero programmate naturalmente a
morire 12 mesi dopo la schiusa.
La recente scoperta di questo fattore apoptotico e la disponibilità di
strumenti offre l’opportunità di testare il composto attivo estratto ed
isolato da diatomee messe in coltura, su cellule neoplastiche umane
per verificare il suo potenziale e chiarirne il meccanismo d’azione.
Obiettivi della ricerca
1- Estrarre, isolare e purificare i fattori apoptotici dalle diatomee;
2- Investigare sulle possibili applicazioni testandone l’attività
antitumorale su cellule umane.
Il programma in dettaglio è diviso in 4 fasi distinte:
• Le diatomee bentoniche del genere Cocconeis sono state isolate e
purificate per ottenere colture monoclonali; la biomassa è stata
cresciuta e poi seccata;
• Preparazione di estratti dell’ alga mediante solventi (acqua, etanolo,
butanolo e metanolo).
• Gli estratti sono stati testati su un gamberetto modello per confermare
la presenza del fattore apoptotico; in particolare una frazione di
diatomee seccate è stata cibo per H.inermis per testare l’attività
apoptotica attraverso misurazioni biometriche e strumenti molecolari.
• Gli stessi estratti sono stati somministrati a linee cellulari umane, sia
neoplastiche che sane, per misurare l’attività anti-proliferativa, la
tossicità specifica e la cascata apoptotica.
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Prima fase: Selezione, colture di diatomee ed estrazione.
La selezione di colture di diatomee rappresenta la prima fase
indispensabile di ricerca. Da quando è stato dimostrato che le
diatomee del genere Cocconeis sono responsabili dell’apoptosi della
gonade dei gamberetti, queste sono state isolate e fatte crescere in
coltura e identificate con il microscopio a scansione elettronica.
Altri generi di diatomee sono stati isolati e messi in coltura per
provvedere a controlli e paragoni.
L’attività di queste specie di diatomee è stata inizialmente testata
usando i nuovi strumenti disponibili su un organismo modello
H.inermis per accertare la presenza del fattore nei cloni di microalghe
in coltura. In seguito, tali cloni sono stati coltivati massivamente,
seccati e soggetti ad estrazione usando opportuni solventi.
Gli estratti sono stati mescolati al cibo secco e analizzati in vivo per
confermare la loro bioattività. Infatti, è difficile ottenere colture
massive di diatomee bentoniche (crescono in superficie e non in
volume) ed è necessario ottenere un grande quantità di biomassa secca
perché sia sufficiente per effettuare analisi chimiche e per le
estrazioni.
Per produrre una quantità massiva di microalghe bentoniche è stato
usato metronidazolo affinché ci sia bassa adesione al substrato.
Alternativamente, colture massive possono essere prodotte attraverso
l’uso di numerose piastre petri su tavoli illuminati, lavabili e
termoregolabili. Questo metodo è più lento in laboratorio, ma può
portare ad una sufficiente produzione di alghe se il sistema è curato.
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Seconda fase: Analisi in vivo.
L’analisi sull’organismo modello Hippolite inermis rappresenta uno
strumento comune utilizzato per tracciare la presenza del fattore
apoptotico. Questa analisi in vivo consiste nell’aggiunta di materiali
(biomassa secca, estratti secchi) al pellet dato come nutrimento alle
larve del gamberetto. L’analisi è durata circa 25 giorni ed ha portato
ad una rapida distruzione per apoptosi del tessuto gonadico e della
ghiandola AG osservato tramite misure biometriche e molecolari.
L’apoptosi di specifiche cellule è chiaramente identificata a
fluorescenza tramite microscopio confocale.
Terza fase: Purificazione e caratterizzazione chimica del fattore
apoptotico.
È stato necessario isolare e determinare la struttura e la stereochimica
delle biomolecole responsabili dell’attività apoptotica. Gli esemplari
di diatomea sono stati sottoposti ad estrazione con solventi organici e
gli estratti grezzi sono stati preliminarmente analizzati e comparati
tramite cromatografia TLC.
Diversi eluenti e reagenti sono stati usati per identificare le molecole
organiche. La frazione attiva è stata poi purificata tramite le classiche
e altamente affidabili tecniche cromatografiche quali la TLC ma anche
MPLC e HPLC.
La determinazione della struttura del composto puro è stata eseguita
tramite spettromicroscopia (mainly nuclear magnetic resonance) e da
spettrometria di massa (EIMS, GCMS, LCMS) assistite da metodi
chimici. In particolare
1
H e
13
C NMR con la moderna correlazione bi-
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dimensionale di sequenze (COSY, TOCSY, HMBC, HMQC) e
spettroscopia ad infrarossi e ultravioletta.
La stereochimica è stata determinata utilizzando la diffrazione ai raggi
X e la tecnica del dicroismo circolare così come metodi chimici.
Durante l’analisi della struttura si è dovuto preparare derivati dei
prodotti naturali attraverso modificazione dei gruppi funzionali e/o la
degradazione di molecole.
Dai risultati delle reazioni chimiche e dall’interpretazione
spettroscopica dei derivati formatisi si possono ottenere importanti
informazioni per la determinazione strutturale.
Tuttavia, si devono ancora conoscere altri aspetti riguardanti la
reattività delle molecole che potranno essere usate per dirigere
modificazioni funzionali e strutturali per aumentare l’attività
farmacologia e biologica dei fattori.
A questo punto si potrà anche includere la sintesi dei prodotti naturali
attivi e allestire librerie chimiche attraverso tecniche combinatoriali.
Quarta fase: Testare l’effetto degli estratti su linee cellulari umane
neoplastiche e normali.
La resistenza ai farmaci può essere conseguenza dell’incapacità delle
cellule tumorali di causare apoptosi indotta da farmaci citotossici.
I nuovi agenti farmaceutici, interagendo con le vie di segnalazione
apoptotiche, procurano uno specifico regime di trattamento o
aumentano l’efficacia, e ciò sarebbe di enorme beneficio clinico.
È stato testato l’effetto dei composti purificati in alcuni modelli
cellulari umani.
L’apoptosi può essere indotta sia da stress intracellulare, mediato dai
mitocondri, sia dalla sagnalazione, mediata dai recettori. Entrambe le
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vie di segnalazione intrinseca ed estrinseca portano all’attivazione
progressiva delle caspasi regolate a livelli multipli per salvaguardare
la scelta di sopravvivenza o di morte cellulare. I principali membri di
proteine regolatorie sono IAP e la famiglia Bcl-2.
L’induzione dell’apoptosi da parte dei fattori estratti dalle diatomee è
stata indagata su varie linee cellulari: linee leucemiche umane, il
normale EBV, linee cellulari B trasformate, tumori solidi (carcinoma
mammario).
Le cellule sono state coltivate a vari intervalli di tempo in presenza
dell’estratto e l’apoptosi è stata controllata durante il ciclo cellulare
(analisi attraverso citometria a flusso del legame annessina –V, del
ciclo cellulare, della frammentazione del DNA e della morfologia
cellulare).
Riassumendo:
• L’ingestione della diatomea Cocconeis sp. induce lo sviluppo
primario in femmine.
• Lo sviluppo di femmine più grandi è dovuto alla distruzione della
gonade maschile per apoptosi.
• Lo stesso meccanismo d’azione si verifica sia in vivo che in vitro.
• L’azione degli estratti apoptotici è specie specifica ed estremamente
selettiva per la gonade maschile e la ghiandola AG.
• L’estratto apoptotico potrebbe essere efficace anche su cellule umane.
Gli scopi della mia ricerca sono:
• Produrre colture massive di diatomee che mostrano alta attività.
• Ottenere biomassa secca sufficiente.
12
13
• Isolare una frazione di diatomee contenenti i composti
biologicamente attivi.
• testare l’attività anti-cancerogena dei composti contro diverse linee
cellulari neoplastiche umane cresciute in vitro.
• Studiare il meccanismo d’azione attraverso il quale gli estratti
inducono l’inibizione della crescita e l’apoptosi nelle cellule tumorali.
Il futuro sarà:
• testare l’efficacia in vitro, su tessuto rappresentativo, per chiarire il
meccanismo d’azione.
• Analizzare la struttura chimica degli estratti contenuti nella frazione
di diatomee.
• Isolare l’effettivo fattore diatomeico (principio attivo) responsabile
dell’induzione apoptotica.
• Obiettivo finale delle ricerche sarà la valutazione in termini di
attività, efficacia e tollerabilità del nuovo farmaco nel trattamento
del carcinoma mammario.
Progetto finanziato da UE: pharmapox
Capitolo 2
Rivista di letteratura
2.1 La storia della ricerca
Hippolite inermis è un piccolo gamberetto che vive nelle acque poco
profonde del Mediterraneo e lungo la costa atlantica della Spagna.
(Zariquiei,1968). Esso forma una popolazione stabile soprattutto negli
habitat della Posidonia oceanica e della Cystoseira nodosa. (Gambi et
al. 2002). Molti individui esibiscono verdi colori mimetici. (Bedini et
al. 1997). Questo crostaceo decapode è caratterizzato da un particolare
tipo di reversibilità sessuale influenzata dal cibo proveniente dalle
diatomee (Reverberi e Veillet et al. 1963); studi dimostrano che
individui maschi cambiano fenotipo sessuale in femmine dato che la
loro dieta è basata sul consumo di microalghe. (Le Roux, 1963).
Il differenziamento sessuale avviene ad una misura di circa 5-7mm,
mentre la reversibilità sessuale è osservata in individui di 10-13mm
corrispondenti ad un’età di 7-12 mesi. Non tutti gli individui mostrano
reversibilità sessuale, infatti giovani femmine di 5.6mm di lunghezza
sono presenti nella popolazione naturale. Esse sono più piccole e
derivano da un differenziamento diretto.
Le femmine più grandi invece derivano da inversione sessuale di
maschi giovani. Le prime, caratterizzate da uno sviluppo diretto, sono
chiamate beta, mentre le seconde, sono dette alpha. (Zupo,1994).
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Il ciclo vitale dell’ H.inermis è caratterizzato da due periodi diversi
poiché esso depone le uova due volte l’anno: in primavera e in
autunno. Gli individui nati in primavera crescono velocemente e si
sviluppano in femmine o maschi, mentre gli individui nati in autunno,
crescono lentamente e si sviluppano come maschi capaci di cambiare
il loro sesso durante la primavera successiva.
Il periodo di massima abbondanza di femmine beta nella popolazione
naturale corrisponde alla produzione massiva di foglie di Posidonia
oceanica. (Mazzella e Buia,1989; Zupo,1994). Questa specie è
caratterizzata da una particolarità (Reverberi,1950): le gonadi
femminili non sono prodotte da gemme (come accade per gli altri
invertebrati dotati di reversibilità sessuale) ma da cellule
indifferenziate, e perciò, la gonade maschile non può essere
influenzata dagli ormoni prodotti dalla gonade femminile durante il
suo sviluppo. Infatti è stato dimostrato (Zupo 2001, Messina 2002)
che gli effetti dei componenti contenuti in molte diatomee bentoniche
del genere Cocconeis determinano l’apoptosi della gonade maschile,
distruggendola durante il suo sviluppo e permettendo di conseguenza
la maturazione di sole femmine.
L’influenza delle diatomee sull’ecologia riproduttiva e sul ciclo di vita
di altri crostacei, soprattutto cefalopodi, è già stata dimostrata.
(Miralto et al., 1995; Poulet et al.1994). La produzione di estratti di
alghe (aldeidi) nocivi allo sviluppo e alla sopravvivenza ha notevoli
ripercussioni sulla produzione secondaria di plancton.
In particolare è stato dimostrato (Zupo 2001) che alcune diatomee
planctoniche sono capaci di indurre apoptosi negli embrioni e nelle
larve dei cefalopodi marini riducendo la loro capacità di
sopravvivenza: la produzione di uova e l’esito della covata negli
individui dei cefalopodi comuni (Calanus helgolandicus) sono
15
influenzati negativamente dall’ingestione di diatomee planctoniche del
genere Talassiosira.
Perciò sappiamo che sia le diatomee bentoniche che le diatomee
planctonoche, oltre ad essere diverse da un punto di vista ecologico,
producono composti che hanno effetto apoptotico diverso su alcuni
tessuti di vari crostacei: deleterio, per le popolazioni cefalopodi e
regolatorio, per i gamberetti associati alla Posidonia.
È stato osservato che gli individui nati in primavera ingeriscono
grandi quantità di diatomee del genere Cocconeis, mentre queste
microalghe sono quasi assenti nella dieta degli individui nati in
autunno.
Esperimenti di laboratorio (Zupo 2000) hanno confermato tale tesi: è
stato visto che gli individui nati dalle stesse femmine si sviluppano in
maggior misura come maschi o femmine in base rispettivamente,
all’assenza e alla presenza del Cocconeis Neothumensis nella loro
dieta. (De Stefano et al. 2000).
Reverberi (1950) osservò uno specifico meccanismo di reversibilità
sessuale in questa specie. Egli dimostrò che la gonade femminile è
prodotta all’inizio da un tessuto indifferenziato dopo la completa
distruzione della gonade maschile.
Tuttavia il meccanismo di reversibilità sessuale è differente rispetto a
quello osservato negli altri crostacei decapodi dove lo sviluppo
dell’ovario segue la classica via di sviluppo di un’ermafrodita.
(Charniaux-Cotton,1960;1988; Calado et al. 2005).
Per questa ragione Reverberi affermò che H.inermis cambia il suo
sesso ma non era possibile considerarlo ermafrodita, poiché non c’era
la presenza contemporanea della gonade maschile e femminile
(Ginsburger-Vogel e Charniaux-Cotton,1962). La questione è ancora
16
molto dibattuta, poiché è impossibile osservare reversibilità sessuale
in assenza di ovotestis. (Cobos et al. 2005).
In ogni caso è stato dimostrato che la precoce distruzione della gonade
maschile precede lo sviluppo dell’ovario ed è dovuto a morte cellulare
programmata, provocata da composti presenti, in varie concentrazioni,
in diverse diatomee bentoniche. (Raff,1998; Evan e Littlewood,1998;
Vaux and Korsmeyer,1999).
È stato inoltre dimostrato che la distruzione della ghiandola
androgenica e della gonade maschile avviene a stadi post-larvali
precoci: l’apoptosi di questi organi è osservata circa due giorni dopo
la formazione di colonie, quando il composto attivo delle diatomee era
somministrato nella dieta.
L’azione dell’estratto è specifica ed è mantenuta per un tempo
limitato: dal 2° al 12° giorno di sviluppo postlarvale. Il meccanismo
apoptotico è molto veloce e specifico e porta alla completa distruzione
della gonade maschile dal 1° giorno di crescita post-larvale cosicché
appare il sesso femminile senza un singolo ciclo di muta. (Zupo e
Messina).Infatti, in presenza di femmine attive (presenza di un ovario)
con appendici esterne maschili è osservato prima che la muta prenda
posto così come in presenza di maschi attivi (presenza di gonade
maschile matura) con caratteri esterni femminili, quando la muta
precede la distruzione della gonade maschile ed è seguita dalla
distruzione della ghiandola androgenica AG. (AG: Sagi 1998;
Katakura,1989).
È stato dimostrato che le diatomee possono avere effetti nocivi sulla
riproduzione dei cefalopodi ed è stato osservato che i composti
presenti in alcune diatomee planctoniche determinano apoptosi sia in
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embrioni sia nei primi stadi larvali, di conseguenza sembrano incidere
sulla sopravvivenza e sulla variabilità di questi crostacei.
Questo in ogni modo può essere considerato un meccanismo di difesa
usato dalle diatomee per ridurre l’impatto del plancton nella
terraferma durante la loro fioritura. Al contrario, il ruolo apoptotico
nel decapode bentonico H.inermis è da considerare regolativo per
questa specie affinché abbia più alto fitness e sia garantita una
razionale e stabile distribuzione dei sessi nella popolazione.
I composti prodotti dalle diatomee planctoniche e nocivi per i
cefalopodi sono per la maggior parte composti aldeidici. (Miralto et
al.1999). I componenti presenti nelle diatomee bentoniche che
regolano la popolazione dei gamberetti non sono ancora conosciuti.
Ci si è chiesti se i composti che inducono apoptosi nel bentos e nel
plancton sono gli stessi (Hengartner,2000): in tal caso il composto
attivo delle diatomee sui crostacei sarebbe stato considerato omologo
da un punto di vista ecologico. Al contrario, l’attività delle diatomee
nei due sistemi potrebbe essere considerata analoga se gli estratti
apoptotici sono diversi per la popolazione dei crostacei. Sono state
fatte estrazioni sia di diatomee bentoniche sia planctoniche e sono
state somministrati alle larve di H.inermis gli estratti secchi di queste
diatomee per verificare che questo trattamento producesse un effetto
simile su una porzione di femmine mature.
L’identificazione del particolare fattore apoptotico può aprire nuove
strade e può essere cruciale per molti scopi medici (cancro, neoplasie
e trattamenti contro l’Alzhimer).
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