Analisi strutturale di antagonisti adenosinici A3 selettivi mediante cristallografia a raggi x e modellistica molecolare

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CARATTERISTICHE STRUTTURALI DEI RECETTORI ACCOPPIATI A 
PROTEINE G 
La grandezza dei GPCR può variare molto significativamente: da meno di 300 amminoacidi 
a 300-370 residui fino a 350-600 residui per il peptide ormonale a monoammina, a 650-750 
amminoacidi per recettore proteico e anche più di 1100 amminoacidi per il recettore del 
glutammato  ametabotropico. Tutti i membri della famiglia contengono 7 domini idrofobici 
di 20-25 amminoacido di lunghezza, che rappresentano le regioni di transmembrana. Si 
suppone che questi domini siano strutturalmente simili sulla base della struttura della 
batteriorodopsina, per cui sono disponibili dati di diffrazione [1]. Essi  sono formati da α-
eliche orientate a formare una tasca per il binding del ligando. Uno studio sulla 
conformazione della proteina ha portato ad evidenziare che la sequenza N-terminale è 
extracellulare e quella C-terminale intracellulare. Quindi si ritiene che ogni recettore abbia 
una zona N-terminale extracellulare che può variare in lunghezza da meno di 10 
amminoacidi a molte centinaia, seguito poi da tre set di loop extra ed intracellulari e un 
sequenza finale C-terminale. Si stima che la maggioranza dei loop  extra ed intra cellulare sia 
composta da 10 e 40 residui tenendo conto che il terzo loop intracellulare e la sequenza C-
terminale possono avere più di 150 residui. Le sottofamiglie delle GPCR sono caratterizzate 
dalla lunghezza dei segmenti extracellulari ed intracellulari e dall’identità di specifici residui, 
benchè molte caratteristiche siano simili tra i vari recettori : ad esempio, un peso molecolare 
più alto fa supporre che il recettore sia glicosilato e gran parte di esso contenga uno o più 
residui di aspargina nella parte N-terminale, anche se alcuni recettori possono essere 
glicosilati in altri loop extracellulari. La glicosilazione può aumentare il peso molecolare fino 
a 20 kD e il glucoside aggiunto può costituire fino al 30% del peso del recettore totale. 
Anche se la glicosilazione può essere importante nella determinazione della corretta 
distribuzione del recettore nella cellula e nell’espressione cellulare, si ritiene comunque 
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giochi un ruolo minore nel binding degli agonisti della maggior parte dei recettori. Sono 
presenti inoltre un residuo di cisteina al finale C-carbossilico del primo loop extracellulare e 
un secondo nel mezzo del secondo loop extracellulare. Ciò comporta la formazione di un 
importate ponte disolfuro. E’ stato dimostrato nella rodopsina che questo ponte è essenziale 
per il corretto folding della proteina 
SOTTOFAMIGLIE DEI RECETTORI ACCOPPIATI ALLE PROTEINE G 
Si conosce la struttura primaria di più di 300 recettori accoppiati a proteina G, i quali  sono 
suddivisi in sottofamiglie. I criteri seguiti per la loro suddivisione possono basarsi sul tipo di 
ligando oppure sul modo ipotetico in cui avviene il binding, o sul tipo di proteina G con cui 
avviene l’interazione. Si possono distinguere tre grandi tipi di sottofamiglie: la famiglia delle 
rodopsine-simili, delle calcitonine-simili e dei recettori metabotropici del glutammato. Tutti 
hanno in comune il fatto che è presente un ponte disolfuro tra un residuo di cisteina nella 
parte alta del  terzo dominio transmembrana e un altro nel secondo loop extracellulare. La 
batteriorodopsina risulta avere sequenza amminoacidiche completamente diverse dalla 
GPCR, ma presenta una struttura simile a sette eliche. 
La maggior parte dei recettori clonati appartiene alla sottofamiglia “rodopsine-like”, che 
include recettori che legano amine bioattive, lipidi, purine, chinine, endoteline, NPY, opsine 
e rodopsine. Un numero di residui polari sono conservati nella zona transmembranale: Asn18 
su TM1, Asp10 su TM2, Arg26 su TM3 e Asn16 su TM7. Questi residui creano 
probabilmente una rete di legami idrogeno che sono importanti per la struttura del recettore. 
Un quarto loop intracellulare, formato da un residuo di cisteina palmitoato nel segmento C-
terminale, può intervenire nella desensibilizzazione nel recettore. Il secondo loop 
intracellulare e parte del terzo loop intracellulare e parte del segmento C-terminale sono 
coinvolti nella interazione della proteina G.  
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I recettori dell’adenosina, oggetto di questa tesi, appartengono a questa sottofamiglia.. 
Inizialmente i recettori purinergici che mediano gli effetti dell’adenosina erano stati chiamati 
generalmente recettori P1. La scoperta della loro capacità di regolare i livelli intracellulari di 
cAMP ha costituito la base per la loro iniziale classificazione in recettori A
1
, i quali 
inibiscono l’adenilato-ciclasi (responsabile della sintesi di cAMP), e in recettori A
2
, che 
invece la stimolano. L’ulteriore suddivisione dei recettori A
2
 in due sottotipi è stata proposta 
da Daly et al. nel 1983 sulla base della scoperta di siti ad alta affinità per l’adenosina presenti 
sulle membrane delle cellule striatali del ratto e di siti a bassa affinità presenti, invece, nel 
resto del cervello, siti in grado, gli uni e gli altri, di stimolare l’attività dell’adenilati-ciclasi. 
L’esistenza di due distinti sottotipi di recettori A
2
 è stata suggerita anche dalla scoperta della 
presenza di siti ad alta affinità in colture di cellule di neuroblastoma e di siti a bassa affinità 
in cellule di glioma. Questi siti ad alta e a bassa affinità sono stati successivamente chiamati 
rispettivamente recettori A
2A
 e recettori A
2B
. Attualmente la classificazione dei recettori 
adenosinici P1 prevede la loro suddivisione in quattro sottotipi sulla base della diversità delle 
loro strutture molecolari, della loro distribuzione tissutale e dei loro profili farmacologici. Si 
hanno, perciò, recettori A
1 
e A
3
 (che inibiscono l’attività dell’adenilato-ciclasi) e recettori 
A
2A
 e A
2B
 (che stimolano l’adenilato-ciclasi) [2].  
La maggior parte dei peptidi ormonali o neuropeptidi sono ligandi di proteine appartenenti 
alla famiglia delle calcitonine. I peptidi  glucagone-simile, il glucagone, il peptide inbitorio 
della gastrina, secretina, il peptide intestinale vasoattivo, calcitonina,ecc, sono alcuni esempi 
di ligandi che interessano questa sottofamiglia. Il segmento N-terminale (100 –150 residui) di 
questa sottofamiglia contiene sei residui di cisteina che potrebbero interconnettersi attraverso 
ponti disolfuro formando ipoteticamente un dominio di binding del ligando di forma 
globulare. Ci sono inoltre molt residui di prolina conservati localizzati su differenti posizioni 
sui recettori per la rodopsina. 
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Il terzo e più piccolo gruppo di recettori accoppiati  a proteine G è quello dei recettori per il 
glutammato. E’ caratterizzato a un enorme segmento N-terminale (500-600 amminoacidi) e 
un altrettanto grande dominio C-terminale. I segmenti transmembranali sono connessi da un 
piccolo loop e con una sequenza non omologa. 
SISTEMA DI TRASMISSIONE PROTEINE G 
Molti ligandi extracellulari agiscono aumentando la concentrazione di secondi messaggeri 
come l’AMP
 
ciclico,
 
lo ione calcio e fosfatilidinositoli. In molti casi essi usano un sistema di 
trasmissione transmembrana costituito da tre componenti. In primo luogo, il ligando 
extracellulare è riconosciuto da un recettore di  membrana. Il recettore attiva a sua volta una 
proteine G localizzata sul lato citoplasmatico della membrana. 
La proteina G attivata modifica l’attività di un effettore, di solito un enzima o un canale 
ionico. Quest’ultimo determina una variazione di concentrazione di un secondo messaggero 
intracellulare. 
La corrispondente proteine G, chiamate G
s
, stimola l’adenilato ciclasi dopo essere stata 
attivata da una grande varietà di ormoni e neurotrasmettitori, ciascuno dei quali agisce 
attraverso uno specifico recettore. G
s
 e altre proteine  utilizzano un meccanismo molecolare 
che implica il legame e l’idrolisi di GTP. 
 
 
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Figura 2: schema di funzionamento delle proteine G 
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La proteina G
s
 può esistere in due forme. Quando il suo sito che lega il nucleotide 
guanosidico è occupato dal GTP, G
s
 è nella sua forma attiva e può interagire con l’adenilato 
ciclasi, attivandola a sua volta. Quando il sito contiene invece GDP  la proteina G
s
 è inattiva 
e incapace di attivare la ciclasi. 
L’attivazione dell’adenilato ciclasi da parte della G
sα
 è autolimitante; la G
sα
 ha una debole 
attività GTPasica e si inattiva da sola convertendo il GTP in GDP. La G
sα
 inattiva si dissocia 
dall’adenilato ciclasi e si riassocia alla subunità β e γ. In questo modo l’adenilato ciclasi 
ritorna inattiva e la proteina G
s
 ricomposta è pronta per l’interazione con il recettore cui si è 
legato l’ormone. 
La trasduzione del segnale attraverso l’adenilato ciclasi presenta due tappe in sequenza che 
amplificano il segnale ormonale. In primo luogo una molecola di ormone legata al recettore 
attiva cataliticamente diverse molecole di proteina G
s
. In seguito, attivando una molecola di 
adenilato ciclasi, una molecola G
sα
 determina la sintesi catalitica di molte molecole di cAMP. 
L’ effetto di questa cascata è un’ amplificazione del segnale ormonale. A seguito 
dell’interazione G
s
-GTP, la durata dell’attivazione dell’adenilatociclasi dipenderà dalla 
longevità del legame G
s
 a GTP. Infatti, G
s 
legata a GTP rimane attiva per decine di secondi il 
che amplifica enormemente il segnale originario. La famiglia delle proteine G comprende 
proteine diverse fra di loro; oltre alla G
s 
che stimola l’adenilatociclasi, vi sono anche le 
proteine G
i
 (“i” sta per inibitorio), che  si legano ai  recettori per inibire la produzione di 
adenilatociclasi. La sottofamiglia delle G
i
 include due proteine chiamate anche trasducine, 
G
t1
 e G
t2
 ,che mediano la trasduzione dei bastoncelli e nei coni della retina.  
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TABELLA 1: rappresenta la distribuzione e la funzionalità fisiologica delle proteine G 
 
ADENOSINA 
 
 
 
 
 
 
 Figura 3: rappresentazione strutturale tridimensionale dell'adenosina 
   
L’adenosina non è un tipico ormone o neurotrasmettirore, ma è probabilmente il più 
importante neuromodulatore nel sistema nervoso centrale e periferico. Un neuromodulatore è 
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una molecola  che ha effetti modulatori sull’attività neuronale, incrementando o diminuendo 
l’azione della cellula neuronale.  I neuromodulatori sono distinti dai neurotrasmettitori perché 
sono specificatamente coinvolti nella zona presinaptica, rilasciati nello spazio sinaptico, e 
interagiscono  con i recettori post sinaptici. Un neuromodulatore, come l’adenosina, può 
essere liberato molto più facilmente durante una bassa o alta attività metabolica.   
Alcuni esempi del ruolo dell’adenosina possiamo trovarli nella liberazione dal muscolo 
durante una ischemia, e in alcuni casi anche dai muscoli che si contraggono con un apporto 
sanguigno normale, anche se il nucleoside rende conto di una parte della vasodilatazione 
indotta dall’atticità solo nei muscoli veloci di tipo ossidativo.  
I livelli di adenosina nel cervello aumentano con l’ischemia, l’ipossiemia, l’ipotensione, 
l’ipocapnia, la stimolazione elettrica del cervello o gli attacchi epilettici. Per applicazione 
topica, l’adenosina agisce come un potente dilatatore per le arteriose piali. In breve, ogni 
situazione che o riduce l’apporto di ossigeno al cervello o aumenta la richiesta di ossigeno da 
parte del tessuto cerebrale provoca una rapida formazione di adenosina nei tessuti cerebrali. 
Contrariamente al pH e alla concentrazione di  K
+
 , la concentrazione di adenosina nel 
cervello aumenta con l’inizio dello stimolo e rimane elevata per tutto il periodo in cui 
l’ossigeno è insufficiente. L’adenosina liberata nel liquido cerebrospinale durante le 
condizioni di inadeguato apporto d’ossigeno al cervello aumenta e rimane disponibile per la 
reincorporazione negli adenin-nucleotidi del tessuto cerebrale. 
Con tutta probabilità, questi tre fattori, il pH, la concentrazione di K
+ 
e l’adenosina, agiscono 
di concerto per adeguare il flusso ematico cerebrale all’attività metabolica del cervello, ma 
deve ancora essere chiarito come questi fattori interagiscano tra loro nel compiere questa 
regolazione. 
 
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STRUTTURA GENOMICA DEI RECETTORI ADENOSINICI  
La struttura genomica appare essere simile per tutti i recettori dell’adenosina. C’è un 
singolo introne che interrompe la sequenza codificata corrispondente al secondo loop 
intracellulare  [3-5] 
Quando la struttura del recettore più studiato, l’A
1
, fu riportata per la prima volta, venne  
notata la presenza di due grandi trascrizioni [6,7]. I trascritti contenenti tre esoni, chiamati 
esoni 4,5, e 6  furono trovati in tutti i tessuti in cui è espresso il recettore, mentre quelle 
contenenti anche esoni 3, 5, e 6  furono trovati in tessuti che esprimono alte concentrazioni di 
recettori come il cervello, testicoli, e rene. Ci sono due promotori, uno prossimale 
denominato promotore A, e uno distale denominato promotore B, distanti circa 600 paia di 
basi, il promotore B e l’esone 1B sono parti di un introne quando il promoter A è attivo. E’ 
stato ipotizzato che entrambi i promotori non presentino la tradizionale sequenza TATA. [7] 
Il promoter A contiene essenzialmente elementi per l’espressione del recettore A
1
; nei ratti 
l’espressione principale sta nella ß- galattosidasi. In ogni modo  il promoter contiene i siti 
d’attacco del GATA e per NKx2.5, i quali guidano l’attività del promotore e il suo atto 
sinergico.[9] 
IL  promotore B è attivato dai glucocorticoidi. È risaputo che i glucorticoidi possono 
stimolare l’espressione dei recettori  A
1
 nelle cellule DDT
1
 MF-2 e nel cervello. [10] 
La clonazione di molti dei cromosomi 22, dove i recettori A
2A 
sono localizzati suggerisce una 
struttura con due esoni che è simile a quella riportata dal ratto. [11] 
I recettori A
2A 
mostrano un’ibridizzazione nella trascriptasi in molti tessuti esaminati. 
L’espressione dei recettori A
2A
 può essere stimolata dalla protein chinasi ma  non si 
conoscono i fattori della trascrizione. Si può affermare che gli A
2A
  sono polimorfi.