Analisi statistiche su banche dati di strutture di proteine

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purificazione proteica sempre più rapide ed efficienti (Sydor & Nock, 2003). Per 
quanto riguarda poi la cristallografia ai raggi X, tra le numerose innovazioni 
tecnologiche che hanno caratterizzato il settore vanno ricordate: la disponibilità di 
sorgenti di sincrotrone a lunghezza d’ onda regolabile (Walsh et al., 1999a), 
l’utilizzo di dispositivi per la raccolta dati basati su rivelatori CCD (Walsh et al., 
1999b)  e l’ uso della crioprotezione per limitare il decadimento dei cristalli indotto 
dalla radiazione X (Garman, 1999). Metodi innovativi per l’attribuzione delle fasi 
sono stati sviluppati ed estesamente utilizzati, come la tecnica MAD (diffrazione 
anomala a lunghezza d’onda multipla) (Gonzalez et al., 1999), o la tecnica della 
diffusione anomala singola (SAD) (Dauter, 1999). D’altra parte, lo sviluppo di 
algoritmi che minimizzano l’intervento di un operatore esterno, unitamente alla 
disponibilità di una maggiore potenza di calcolo, hanno ridotto il tempo necessario 
all’elaborazione dei dati ed, in ultima analisi, alla risoluzione di una struttura 
cristallografica.  
La possibilità di determinazioni strutturali in una modalità ‘high throughput’ è 
strettamente vincolata alla progressiva automazione degli stadi richiesti per la 
risoluzione di una struttura cristallografica. Tale possibilità ha acquisito grande 
importanza nel contesto dei progetti di genomica strutturale ((Burley et al., 1999; 
Montelione & Anderson, 1999); per maggiori dettagli si consulti il Par. 1.4). Per 
poter sfruttare adeguatamente l’informazione contenuta nelle banche dati di 
sequenza in continua espansione, è necessario accumulare informazioni strutturali 
ad una velocità maggiore di quella attuale. Soltanto alla luce delle relazioni 
intercorrenti tra sequenza, struttura tridimensionale e funzione si potrà utilizzare 
appieno la mole di informazioni sulle strutture primarie proveniente dal 
sequenziamento dei genomi. 
Man mano che il numero delle strutture tridimensionali è andato aumentando nel 
corso degli anni, si è resa necessaria l’implementazione di banche dati di strutture: 
strumenti in grado di archiviare, organizzare e distribuire l’informazione strutturale 
associata alle macromolecole biologiche. Il riferimento centrale del settore è 
costituito dall’archivio Protein Data Bank. 
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1.2   Il Protein Data Bank 
 
Il Protein Data Bank (PDB; http://www.rcsb.org/pdb; (Berman et al., 2000; 
Bernstein et al., 1977) è stato fondato nel 1971 da Walter Hamilton nel 
Brookhaven National Laboratory in risposta alla necessità, da parte della comunità 
scientifica, di un archivio centrale per gestire l’informazione strutturale 
proveniente dalle macromolecole biologiche. All’atto della sua fondazione, il PDB 
includeva solo sette strutture. Gli elementi essenziali dell' format utilizzato per 
codificare queste prime strutture si ritrovano tuttora nei files del PDB. Grazie alla 
sua semplicità ed alla consistenza nella rappresentazione delle strutture 
tridimensionali, il format PDB rimane il mezzo più ampiamente supportato per lo 
scambio di dati strutturali relativi alle macromolecole biologiche. Un file PDB 
consiste in una collezione di records, il cui formato è fissato, che descrivono le 
coordinate atomiche, le proprietà chimiche e biochimiche, i dettagli sperimentali 
relativi alla determinazione della struttura, nonchè alcune caratteristiche strutturali 
quali l'assegnazione della struttura secondaria, la composizione dell’ unità 
biologica e talvolta la descrizione dei siti attivi. 
 Nel corso degli anni Settanta, poche strutture all’anno venivano aggiunte al PDB, 
e gli approcci informatici per la gestione dei dati erano ancora rudimentali. Nel 
decennio successivo, il numero di strutture depositate ha cominciato ad aumentare 
notevolmente. Le cause di tale incremento vanno ricercate nei miglioramenti 
tecnologici associati ad ogni aspetto delle procedure cristallografiche, 
nell’aggiunta di strutture determinate attraverso la risonanza magnetica nucleare 
(NMR), e nell’adozione di un nuovo punto di vista, da parte della comunità 
scientifica, in materia di data sharing. Attualmente nel PDB sono riportate oltre 
23000 strutture di proteine. In relazione a tale rapida crescita, le modalità di 
accesso ai dati del PDB sono cambiate attraverso gli anni, in seguito al 
miglioramento delle tecnologie disponibili. Adesso la distribuzione dei dati 
avviene principalmente attraverso il Word Wide Web (WWW), anzichè tramite 
supporti magnetici, come in passato. Inoltre, la necessità di analizzare differenti 
sottoinsiemi dei dati disponibili, ha condotto allo sviluppo di moderni sistemi 
integrati per la gestione dei dati strutturali. 
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1.3   Le banche dati derivate 
 
Nel corso degli anni l’accumulo di informazioni strutturali nel Protein Data Bank 
ha reso possibile la realizzazione di analisi comparative sui dati a disposizione, con 
il supporto di nuovi algoritmi, elaboratori più veloci per l’esecuzione di tali 
algoritmi su un insieme sempre crescente di dati, e la disponibilità di tecnologie 
informatiche per un accesso efficiente alle informazioni. 
I dati primari reperibili nel PDB sono le coordinate cartesiane, i fattori di 
occupazione ed i parametri di spostamento atomico per gli atomi che costituiscono 
le strutture. Sono riportate inoltre informazioni addizionali come riferimenti 
bibliografici, dettagli dell’esperimento, links alle banche dati di sequenza, ed 
alcune annotazioni relative alla funzione biologica. Raggruppati in una singola 
entry o, a causa delle restrizioni del format PDB, in entries multiple per strutture 
molto grandi, tali dati costituiscono una coincisa descrizione della forma 
tridimensionale di una molecola.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
I
l
 
P
D
Figura 1 - Il flusso dei dati strutturali. L’ informazione primaria deriva direttamente dagli
esperimenti condotti nei singoli laboratori. Informazioni primarie addizionali, come sequenze,
condizioni di cristallizzazione, e strutture di eventuali  ligandi,  sono disponibili come risorse
primarie esterne al PDB. Le varie operazioni che è possibile effettuare sui dati primari consentono
di ottenere un insieme di risorse secondarie.
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Il PDB attualmente rende disponibili con cadenza settimanale i dati primari relativi 
alle nuove strutture depositate. Un gran numero di siti in tutto il mondo acquisisce 
tali dati attraverso Internet, elabora informazioni addizionali e costituisce un 
insieme di risorse secondarie. Il flusso dei dati strutturali è schematizzato in 
Figura 1. Le risorse secondarie comprendono innumerevoli servizi: in Tabella 1 
sono riportati alcuni esempi suddivisi per categorie. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Controllo della qualità stereochimica delle strutture: 
Risorsa Informazione reperibile Riferimenti 
PROCHECK Validazione delle strutture (Laskowski et al., 1993) 
PDBsum Sommario informazioni PDB (Laskowski, 2001))  
 
Classificazione della struttura delle proteine: 
Risorsa Informazione reperibile Riferimenti 
Banca dati SCOP Classificazione strutturale (Murzin et al., 1995))  
Banca dati CATH 
Classe, architettura, 
topologia, superfamiglie 
omologhe di proteine 
(Orengo et al., 1997))  
Banca dati PQS Struttura quaternaria (Henrick & Thornton, 1998))  
 
Strutture proteiche non ridondanti: 
Risorsa Informazione reperibile Riferimenti 
PDBselect 
Insiemi di strutture proteiche 
con identità di sequenza pari 
al 25% o al 90% 
(Hobohm & Sander, 1994))  
ASTRAL 
Insiemi di strutture proteiche 
con identità di sequenza 
selezionabile 
(Brenner et al., 2000))  
 
Metalloproteine e gruppi prostetici: 
Risorsa Informazione reperibile Riferimenti 
Banca dati MDB 
Classificazione strutturale e 
funzionale delle 
metalloproteine 
(Castagnetto et al., 2002))  
Tabella 1 – Esempi di banche dati derivate e risorse per ottenere informazioni addizionali. 
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Il numero delle risorse secondarie aumenta di anno in anno: un elenco aggiornato è 
reperibile alla pagina http://www.pdb.org/pdb/links.html . 
 
 
1.4   Sviluppi recenti 
 
La biologia strutturale è un settore in rapida espansione che impone sfide 
nell’ambito dell’acquisizione, gestione e distribuzione dei dati di struttura. In 
questo contesto, la sfida principale è senza dubbio rappresentata dal concetto di 
genomica strutturale. Con questo termine si indica lo sviluppo e l’utilizzazione di 
determinazioni strutturali high throughput per diversi ed importanti scopi tra cui: la 
completa esplorazione dello spazio di folding delle proteine, con conseguente 
perfezionamento delle tecniche di homology modeling; la determinazione del 
maggior numero possibile di strutture di proteine in relazione ad un dato genoma; 
l’approfondimento, su scala molecolare, delle conoscenze riguardanti patologie 
specifiche e/o particolari percorsi biochimici implicati in patologie. Benchè gli 
obiettivi specifici possano essere differenti, le modalità di realizzazione dei vari 
progetti sono essenzialmente le stesse; la più diretta implicazione di questo 
fenomeno è un aumento esponenziale nella quantità di informazioni strutturali 
disponibili. A partire dal 1999 il numero di strutture depositate nel PDB ha seguito 
mediamente  il ritmo  di  50 entries per  settimana. Attualmente nell’archivio sono 
1974 1977 1980 1983 1986 1989 1992 1995 1998 2001 2004
0
5000
10000
15000
20000
25000
STRUTTURE DISPONIBILI NEL PROTEIN DATA BANK (PDB)
(aggiornamento Dic2003)
n
.
 
d
i
 
s
t
r
u
t
t
u
r
e
Anno
 strutture nuove depositate nell'arco dell'anno
 strutture complessive
Figura 2 - Numero totale di strutture depositate e numero di strutture depositate per anno nel PDB.
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riportate oltre 23000 strutture di proteine (dicembre 2003: 23792 entries). Con 
l’avvio dei numerosi progetti di genomica strutturale sparsi in tutto il mondo, e’ 
evidente che tale numero è destinato ad aumentare in modo considerevole: si stima 
infatti che il PDB dovrebbe contenere circa 35000 entries per il 2005. In Figura 2 
è riportato il numero di strutture depositate per anno, assieme al numero 
complessivo di strutture disponibili. La Figura 3 evidenzia invece il parallelo 
esistente tra aumento numerico delle entries e crescente complessità delle strutture 
depositate: dalle piccole proteine globulari degli esordi fino alla complicata 
macchina molecolare del ribosoma. 
 
È importante notare che all’aumento quantitativo dei dati disponibili fa riscontro 
anche un miglioramento qualitativo dei informazioni strutturali, nel senso di 
strutture determinate con maggiore accuratezza. In conclusione, il PDB 
attualmente contiene una massa critica di informazioni strutturali ad alta 
risoluzione su cui è possibile condurre una varietà di analisi statistiche. Molte di 
tali iniziative mirano ad delucidare i principi che dirigono l’organizzazione 
molecolare dei siti attivi, nonchè allo sviluppo di algoritmi knowledge-based per 
una predizione accurata di struttura e funzione delle proteine. In particolare, un 
Figura 3 - Numero totale di strutture disponibili nel PDB per anno, con  esempi di strutture
depositate in differenti periodi:  
(a) mioglobina; (b) emoglobina; (c) lisozima; (d) RNA transfer; (e) anticorpi; (f)  virus; (g) actina;
(h) nucleosoma; (i)  miosina, s; (j) subunità del ribosoma; (k) pompa del calcio. 
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ampio insieme di dati strutturali disponibili consente di estrarre informazioni 
significative anche per quelle categorie di dati intrinsecamente rare e poco 
ricorrenti. In questo contesto si inquadra lo studio di elementi strutturali poco 
frequenti (ma di notevole importanza funzionale), nonché le analisi 
conformazionali sulla distribuzione dei residui amminoacidici in regioni non 
strutturate delle proteine. 
 
 
1.5. Obiettivi generali del progetto di tesi 
 
Nell’ambito del presente progetto di tesi ci si propone di studiare il motivo 
strutturale denominato poliprolina II (PPII), nonchè di valutare l’energia 
conformazionale dei differenti amminoacidi in regioni non strutturate delle 
proteine. 
Le eliche di PPII sono coinvolte in importanti processi biologici quali la traduzione 
dei segnali, la trascrizione, la motilità cellulare e la risposta immunitaria (Kay et 
al., 2000). Eliche di PPII sono, inoltre, costituenti fondamentali di proteine 
strutturali quali il collageno (Beck & Brodsky, 1998) ed alcune glicoproteine della 
parete cellulare delle piante (Ferris et al., 2001). Utilizzando le informazioni 
disponibili nelle banche dati strutturali sono state condotte analisi statistiche volte 
a identificare le eliche PPII ed a valutare le propensioni dei diversi amminoacidi 
per questo motivo strutturale. È opportuno ricordare che analisi statistiche 
analoghe, effettuate in passato su un numero ridotto di strutture di proteine 
(Adzubhei & Sternberg, 1993; Stapley & Creamer, 1999), hanno portato a risultati 
discordanti (cfr. Par. 2.3.3a) È dunque ragionevole che uno studio basato su un più 
ampio insieme di dati possa fornire valori delle propensioni statisticamente più 
significativi. Le linee di sviluppo principali possono essere così schematizzate: 
 
¾ confronto delle propensioni statistiche con quelle sperimentali 
recentemente determinate (Rucker et al., 2003); 
¾ analisi dei determinanti strutturali per le propensioni; 
¾ valutazione dei contesti strutturali in cui le eliche di PPII sono collocate; 
¾ correlazione tra informazioni statistiche e ruolo biologico delle eliche PPII. 
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Parallelamente, utilizzando le informazioni contenute nel PDB  sono state 
determinate, per ciascun amminoacido, mappe di energia conformazionale 
‘empiriche’ ottenute valutando la distribuzione dei conformeri in regioni non 
strutturate delle proteine. Lo studio e’ stato condotto analizzando gli spazi 
conformazionali di ciascun residuo amminoacidico ed identificando le 
conformazioni più o meno favorite. Per ogni residuo di una data proteina sarà 
possibile valutare la differenza di energia tra la conformazione adottata ed il suo 
minimo assoluto. Mediando i valori associati a tutti i residui di una proteina si puo’ 
ottenere una stima della variazione di energia per l’intera macromolecola. 
L’andamento di questo parametro verrà valutato in funzione delle dimensioni della 
catena polipeptidica, per uno studio delle variazioni di energia conformazionale 
associate al processo di strutturazione delle proteine.