Analisi di identità, parentela e diversità genetica nel germoplasma di vite

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1. INTRODUZIONE 
 
1.1 La vite 
 
1.1.1 Caratterizzazione botanica 
 
La vite (Vitis vinifera L.) e' un aggregato di forme coltivate e selvatiche distribuite in primo 
luogo dall'Asia occidentale all'Europa (Zohary e Hopf 2000).  
La vite europea (Vitis vinifera sativa) appartiene al genere Vitis, famiglia Vitaceae o 
Ampelidee, ordine Rhamnales, sottoclasse Archiclamidee, classe Dicotiledoni. 
Al genere Vitis appartengono circa 40 specie asiatiche e 30 specie americane, comprendenti 
due sottogeneri: Muscadinia e Euvitis. 
Le specie appartenenti al sottogenere Muscadinia sono: Vitis rotundifolia,  Vitis munsoniana 
e Vitis popenoei. Esse possiedono un patrimonio cromosomico 2n=40 e sono caratterizzate 
dalla forma dei vinaccioli quasi tondeggiante e dall‟assenza di ritidoma (la parte più esterna 
della corteccia). 
La Vitis rotundifolia è una specie naturale tipica delle coste meridionali degli USA e del 
Messico. 
Essendo molto resistente alle malattie crittogamiche, alla fillossera e ai nematodi, è stata 
utilizzata in esperimenti di ibridazione con la V . vinifera L. e per ottenere nuovi portinnesti 
resistenti a fillossera e nematodi. 
Il sottogenere Euvitis ha patrimonio cromosomico 2n=38, i vinaccioli hanno forma 
piriforme e le parti legnose della pianta presentano il ritidoma. Può essere suddiviso in base 
ai climi ed alle zone geografiche di diffusione delle diverse specie che vi appartengono e, 
quindi, comprende: 
 il gruppo delle viti americane; 
 il gruppo delle viti asiatiche orientali; 
 il gruppo delle viti euro-asiatiche.
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Nel gruppo delle viti americane troviamo specie polimorfiche con caratteristiche 
interessanti. 
Alcune sono resistenti al freddo, altre alla peronospora o alla fillossera. Altre ancora hanno 
scarsa o nulla attitudine uvifera. Le specie più note sono: Vitis rupestris, Vitis riparia e Vitis 
berlandieri, usate come portinnesti o per ottenere ibridi da utilizzare come portinnesti. 
Al gruppo delle viti asiatiche orientali appartengono specie resistenti al freddo invernale e 
alla peronospora, ma scarsamente alla fillossera, con attitudine uvifera. 
Le specie più note sono: Vitis labrusca e Vitis aestivalis, quest‟ultima utilizzata 
nell‟ibridazione per la produzione di portinnesti resistenti alle malattie. 
Le viti del gruppo euro-asiatico sono tipiche dei climi temperati o temperato-freddi ed 
originarie dell‟Asia. Ne fa parte la Vitis vinifera L.: naturalizzata da sempre nel bacino  del 
Mediterraneo ed in Europa, è la specie più importante del mondo, avendo insuperate 
attitudini qualitative. E‟ però molto sensibile alle malattie.  
Presenta due sottospecie: Vitis vinifera silvestris o vite selvatica e Vitis vinifera sativa o vite 
europea. La V. vinifera silvestris è selvatica, dioica, cresce spontaneamente in Europa ed è 
resistente alle malattie, mentre la V . vinifera sativa è ermafrodita, deriva da V . silvestris ed è 
la più coltivata (Fregoni 2005).
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1.1.2 La domesticazione della vite 
 
La domesticazione della vite e' iniziata nel Neolitico, approssimativamente 8,000 anni fa 
quando le popolazioni umane iniziarono a raccogliere e propagare forme ermafroditiche e/o 
partenocarpiche, selezionate tra progenitori selvatici di  V . silvestris (Olmo 1995, This et al 
2006).  
Dalla prima area di domesticazione, più' probabilmente nelle coste meridionali del Mar 
Nero e del Mar Caspio e nelle vicinanze, le forme domesticate si diffusero verso occidente 
ed arrivarono nel bacino mediterraneo seguendo i principali eventi di civilizzazione e 
colonizzazione  (Zohary e Hopf 2000).  
La coltivazione della vite si espanse poi all'interno, raggiungendo diverse regioni temperato-
fredde dell'Europa e dell'Asia (This et al 2006). 
Un inventario preparato da Alleweldt nella meta' degli anni '80 ha rivelato l'esistenza di più 
di 14'000 accessioni in qualche modo descritte, la maggior parte delle quali e' rappresentata 
da varieta' di V . vinifera varieties (Alleweldt et al 1990).  
L'origine della maggior parte di queste e' completamente ignota a causa del frequente 
scambio di materiale vegetale tra i numerosi centri secondari di domesticazione e la 
probabile ibridazione tra le  forme domesticate di V . vinifera var. sativa  e le sue forme 
selvatiche di V . vinifera var. silvestris, le quali hanno distribuzione geografica sovrapposta 
(Arroyo-García et al 2006).  
Fino al diciannovesimo secolo, i vigneti erano costituiti con molte varietà' differenti, e 
questo probabilmente ha dato luogo ad una naturale e vasta ibridazione. 
Dozzine di progenie derivanti da Pinot, Gouais e Chardonnay sono state identificate tra le 
varietà note in occidente  (Bowers et al 1999, Boursiquot et al 2004) e molti vecchi genotipi 
di pregio hanno dato origine a grandi famiglie di cultivar, come i Moscati (Crespan e Milani 
2001), le Malvasie (Lacombe et al 2007), i Sangiovesi (Di Vecchi Staraz et al 2007) ed altre. 
Inoltre, l'estensiva propagazione vegetativa di diverse cultivar antiche, come Afus Ali, 
Chasselas, Grenache, Moscato, Pinot nero, Sangiovese, Sultanina, e altre, ha dato origine a 
molte varianti clonali che hanno contribuito alla differenziazione del pool genetico della vite 
(Calò et al 2001, This et al 2006, Lacombe et al 2007, Di Vecchi Staraz et al 2007, Ibáñez et 
al 2009).
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Nella seconda metà del diciannovesimo secolo, i vigneti europei furono devastati da 
malattie fungine e dalla fillossera,  introdotte tutte dall'America, le quali causarono una 
drammatica riduzione della diversità genetica. 
 
1.1.3 La vite oggi 
 
Nel ventesimo secolo, lo sviluppo globale dell'industria dell'uva da vino ha ridotto 
ulteriormente le varietà' coltivate, portando alla diffusione globale di un ristretto numero di 
varietà'  prevalentemente di origine francese  (Alleweldt et al 1990).  
Molte varietà' locali tradizionalmente coltivate furono abbandonate in favore di varietà' più 
adatte alla domanda del mercato del vino, e solo recentemente sono state reintrodotte nelle 
coltivazioni, in omaggio all'eredita' culturale e alle tradizioni locali, e per diversificare 
localmente il mercato. 
Oltre al fattore economico, le vecchie varietà locali hanno avuto una storia duratura ed 
interessante, legata alle terre dove venivano solitamente coltivate, diventando parte 
integrante del paesaggio,delle pratiche agricole tradizionali e della storia delle popolazioni 
umane. 
C'è' un interesse crescente nella comprensione dell'origine e della diversità' genetica del 
germoplasma raccolto in differenti aree geografiche, come anche nel risolvere la 
complessità' delle parentele tra questo complesso germoplasma e la relazione tra questo e le 
varietà' interazionali maggiormente conosciute.
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1.2 I marcatori molecolari basati sull'analisi del DNA 
 
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 
 
L‟uso degli enzimi di restrizione e l‟ibridazione del DNA, hanno permesso lo sviluppo della 
prima classe di marcatori molecolari, gli RFLP (Restriction Fragment Length 
Polymorphism), caratterizzati da polimorfismi basati sull'attività di enzimi di restrizione e 
rivelati in Southern blotting con sonde spesso eterologhe. 
Gli RFLP sono diventati molto popolari con la scoperta del DNA ripetuto, in particolare il 
DNA minisatellite, che ha dato avvio al fingerprinting in campo umano, diventato a sua 
volta popolare per la celebrità assunta dal suo utilizzo come prova di colpevolezza, di 
paternità ecc.  Sono attualmente abbandonati in favore di marcatori amplificati in PCR (SSR 
e altri) e SNP. 
 
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 
 
I marcatori RAPD sono stati ideati da Welsh et al. (1990) e sono realizzati utilizzando 
oligonucleotidi random aventi una lunghezza di circa 10 basi. Tali oligonucleotidi vengono 
impiegati come primers per una reazione di PCR random in cui il profilo degli ampliconi 
risultanti dipende dai polimorfismi presenti nel DNA genomico analizzato. Questi marcatori  
sono semplici da usare poiché non richiedono informazioni di sequenza preliminari. 
Nonostante queste buone caratteristiche l‟uso di questo tipo di marcatori è stato 
abbandonato poiché la metodologia è di tipo random, i risultati dipendono quindi dalle 
condizioni di reazione, dall‟operatore e dal sistema di analisi e sono quindi poco 
riproducibili.
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AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 
 
I marcatori AFLP possono essere considerati simili ai RAPD poiché non necessitano di 
informazioni preliminari sulla sequenza ma hanno un maggior contenuto informativo, cioè 
consentono di evidenziare un maggior numero di differenze. 
Prevedono un primo step di restrizione del DNA seguito dalla ligazione di oligonucleotidi 
adattatori e dalla successiva analisi mediante reazioni di PCR preselettiva e selettiva.. 
I primers utilizzati per l‟amplificazione sono specifici al 5‟ per gli adattatori impiegati 
mentre al 3‟ presentano una o due basi casuali che permettono quindi di selezionare e ridurre 
il numero di frammenti risultanti dall‟analisi di restrizione.  
Tale tecnica è stata utilizzata per la prima volta nel 1995 da V os et al. e permette di ottenere 
dei risultati meglio analizzabili rispetto ai RAPD. Deve essere comunque utilizzata 
particolare attenzione durante ogni singolo passaggio della tecnica poiché è anch‟essa 
un‟analisi di tipo random ed estremamente influenzata dalle condizioni di reazione, 
dall‟operatore e dal metodo di analisi dei risultati. Anche in questo caso è possibile 
effettuare un‟analisi automatizzata utilizzando l‟elettroforesi capillare. 
 
SNP (Single Nucleotide Polymorphism) 
 
Gli SNPs sono mutazioni che avvengono naturalmente e che riguardano un singolo 
nucleotide. Essi costituiscono la stragrande maggioranza di tutti i polimorfismi di sequenza 
nella parte eucromatica di quasi tutti i genomi e sono classificati a seconda della natura del 
nucleotide coinvolto.  
Gli SNP non codificanti possono trovarsi nelle regioni non trascritte in 5‟ o in 3‟ (NTR), 
nelle regioni non tradotte in 5‟ o in 3‟(UTR), in un introne, oppure tra un gene ed un altro 
(SNP intergenici) mentre gli SNP codificanti possono essere polimorfismi di sostituzione 
(cioè che cambiano l‟aminoacido codificato), oppure polimorfismi sinonimi. 
I polimorfismi di non sostituzione comprendono polimorfismi sinonimi e non codificanti, 
molti dei quali possono comunque influenzare le funzioni del gene attraverso effetti sulla 
regolazione trascrizionale e traduzionale, sullo splicing o sulla stabilità dell'RNA. 
Un‟altra possibile classificazione degli SNP è in transizioni o trasversioni. Le transizioni
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trasformano una purina in un‟altra purina, o una pirimidina in un‟altra pirimidina (es. A→G,  
C→T e viceversa). Le trasversioni invece trasformano una purina in una pirimidina e 
viceversa  (es. A o G → C o T). In pratica le transizioni tendono ad avvenire con una 
frequenza maggiore (2/3) per via dei diversi meccanismi di riparazione evoluti dai sistemi 
biologici, e dalla frequenza di deaminazione della 5-metilcitosina. 
 
In più a causa della natura del codice genetico è meno probabile che le transizioni 
modifichino gli amminoacidi rispetto alle trasversioni; di conseguenza le transizioni sono 
mantenute nelle regioni codificanti con una probabilità maggiore. 
Per quanto riguarda applicazioni in analisi di diversità genetica, gli SNP offrono il vantaggio  
del loro elevato numero e della possibilità di automatizzare il processo di genotipizzazione. 
 
STR (Short Tandem Repeats) 
 
Tra le varie categorie di marcatori molecolari proposti negli ultimi venti anni (vedi 
Schlötterer 2004), gli SSR o Simple Sequence Repeat markers sono i marcatori più' 
utilizzati per genotipizzare gli individui e quindi risolvere problemi di omonimia, sinonimia, 
parentela e per dedurre la struttura genetica delle popolazioni. 
I marcatori SSR, conosciuti anche come STR (Short Tandem Repeats), o microsatelliti, sono 
sequenze di DNA ripetute a tandem costituite da unita' di 1-6 paia di basi, dette „core repeat‟ 
o „core motif‟. Oltre alla loro abbondanza nei genomi delle piante, una caratteristica che gli 
SSR condividono con altri tipi di marcatori, una caratteristica di pregio e' l'alto livello di 
variabilità nel numero delle ripetizioni della loro unita' centrale („core motif‟), mostrando a 
volte dozzine di alleli per ogni locus. 
Si amplificano attraverso la Reazione a Catena della Polimerasi (PCR), usando due primer 
che si appaiano alle regioni fiancheggianti la ripetizione: il bersaglio e' pertanto un singolo 
locus nei genomi diploidi. Un'altra caratteristica interessante e' che sono altamente 
riproducibili e non richiedono scambi di DNA tra laboratori, come richiedono gli RFLP. 
I range allelici e le varianti alleliche degli STR vengono rilevati usando comparazioni con 
ladders allelici standardizzati che possiedono gli alleli più comuni, che sono stati 
sequenziati per rivelare il vero numero delle ripetizioni.
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Quando molti campioni vengono analizzati con i loci SSR, vengono costantemente scoperti 
nuovi alleli che non hanno esattamente la stessa dimensione degli alleli del ladder. Questi 
alleli possono essere varianti con più o meno ripetizioni della „core repeat‟ rispetto ai 
comuni alleli che si trovano nei ladder allelici disponibili in commercio. 
In alternativa, queste varianti alleliche potrebbero contenere ripetizioni parziali, 
inserzioni/delezioni nelle regioni fiancheggianti la ripetizione centrale. 
In più, possono essere scoperti nuovi alleli che compaiono al di fuori del range definito dai 
ladder. 
Nell'ultimo decennio, i profili di DNA basati sui marcatori molecolari hanno profondamente 
cambiato il modo in cui sono state condotte le analisi di diversità genetica e la 
genotipizzazione delle varietà negli alberi da frutto e in vite. 
 
I marcatori microsatelliti si sono dimostrati utili nelle analisi di parentela e nella 
caratterizzazione genetica delle cultivar, ma le ripetizioni di-nucleotidiche e un ridotto 
numero di tri-nucleotidiche sono le uniche usate correntemente negli alberi da frutto e nella 
vite. 
Nel passato erano già' state proposti la standardizzazione e lo scambio di informazioni 
riguardo le risorse genetiche della vite usando marcatori microsatelliti di riferimento. 
Molte serie di marcatori SSR sono state proposte per la vite, e la serie più' conosciuta e' 
stata  presentata dal gruppo europeo coinvolto nel progetto europeo GENRES (This et al 
2004).  
Questa serie e' basata su sei marcatori microsatelliti ad alta riproducibilità' con ripetizioni 
di-nucleotidiche (This et al 2004).  
Sebbene la lista dei marcatori sia stata estesa a venti (Di Vecchi Staraz et al 2007) e il 
protocollo proposto appaia sufficientemente affidabile e riproducibile, dato che prevede 
l'uso di genotipi di riferimento per le dimensioni alleliche, i microsatelliti  di-nucleotidici 
rimangono problematici a causa dello stuttering e della breve distanza tra gli alleli che va a 
complicare il binning (Idury and Cardon 1997, Amos et al 2007). 
Per questo motivo, sono stati scartati nel fingerprint umano in favore di microsatelliti con 
ripetizioni centrali più lunghe (Butler 2006).   
Microsatelliti con una ripetizione centrale più lunga sono meno frequenti nel genoma e
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difficili da isolare tramite librerie di DNA genomico , anche se arricchite in motivi SSR, ma 
nel 2007 con la sequenza completa del genoma della vite (Jallion et al 2007), e' stato 
possibile recuperare dal database NCBI decine di migliaia di  SSRs con ripetizioni centrali 
di tre o cinque  nucleotidi (Cipriani et al 2009). 
Negli SSR tetra e penta-nucleotidici, gli alleli ravvicinati sono separati e identificati più 
facilmente tra loro rispetto agli SSR di-nucleotidici.  
 
 
 
In una ricerca condotta recentemente dal gruppo di genetica delle piante da frutto e della 
vite dell‟Università di Udine, 38 nuovi SSRs con ripetizioni centrali da tre a cinque 
nucleotidi sono stati selezionati a partire da un totale di 26.962 microsatelliti. 
Il lavoro è basato sulla sequenza del genoma di vite, ottenuta a partire da un genotipo 
altamente omozigote, il PN40024. 
I marcatori SSR sono stati selezionati in base alla qualità dei picchi, al potere discriminante 
e alla distribuzione uniforme sul genoma (Figura 1).