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Capitolo 1
Introduzione
Questa tesi si inserisce nell’ambito di un progetto di ricerca sviluppato presso il
Dipartimento di Chimica Applicata e Scienza dei Materiali (DICASM) e relativo
alla produzione di vanillina mediante bioconversione di acido ferulico ad opera
di Pseudomonas fluorescens BF13-1p, mutante del ceppo BF13 dotato di un
blocco a livello del gene che codifica per l’enzima per il catabolismo della
vanillina ad acido vanillico.
Fig. 1.1: formula di struttura della vanillina [1].
La vanillina (fig. 1.1) è un’aldeide aromatica (4-idrossi-3-metossibenzaldeide)
che allo stato puro si presenta sotto forma di piccoli cristalli aghiformi di colore
bianco caratterizzati da un intenso profumo di vaniglia.
Di seguito (tab. 1.1) se ne riportano le principali proprietà chimico-fisiche [1]:
Formula C
8
H
8
O
3
Massa molare 152,15 kg/kmol
Densità 1,056 g/cm
3
(20°C)
8
Temperatura di fusione 80–81°C
Temperatura di ebollizione 285°C
Solubilità in acqua 10 g/L (25°C)
Tab. 1.1: principali proprietà chimico-fisiche della vanillina.
Si tratta di una molecola molto interessante dal punto di vista industriale: per le
sue proprietà spiccatamente aromatiche essa viene largamente utilizzata
nell’industria alimentare come ingrediente di cibi (in particolare dolci e dolciumi
in quantità dell’ordine di qualche centinaia di ppm) e bevande; inoltre, a causa
del suo discreto potere antiossidante, antisettico (in particolare verso muffe e
funghi) e repellente, trova frequente impiego come conservante per confetture
[2]. In quest’ultimo caso, per evitare un’alterazione a carico del profumo del
prodotto conservato, è opportuno aggiungerla in piccole dosi, associandola ad
altri composti dotati delle stesse caratteristiche funzionali.
La vanillina riveste un ruolo importante anche in ambito chimico e farmaceutico:
il 50% della sua produzione trova infatti applicazione come intermedio nella
sintesi di erbicidi, antischiuma, farmaci, profumi [3] e cosmetici.
La vanillina viene attualmente ottenuta per via naturale, cioè a partire dai baccelli
di Vanilla planifolia, oppure per via chimica da tre diverse materie prime:
eugenolo o isoeugenolo, lignina e guaiacolo.
La complessità del processo di estrazione della vanillina dai baccelli, nonché il
possibile verificarsi di carenze legate alle condizioni locali di produzione (come
nel caso del ciclone che nel 2001 colpì il Madagascar, il principale produttore di
baccelli a livello mondiale [4]) rendono la vanillina ottenuta per via naturale
estremamente costosa (2000 – 3000 $/kg, pari a circa 1400 - 2100 €/kg [5]) ed in
grado di soddisfare solo lo 0,25% del fabbisogno mondiale (circa 40 tonnellate
l’anno [6]).
Introduzione
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La restante richiesta di vanillina (circa 16000 tonnellate l’anno [6]) viene coperta
dalla produzione per via chimica, da cui si ottiene un prodotto piuttosto
economico (5-15 $/kg, pari a circa 3,5 – 11 €/kg [5]), ma di qualità molto
inferiore rispetto all’aroma naturale, a causa dell’inevitabile presenza di impurità.
La crescente spinta del mercato mondiale verso prodotti a base di aromi unita alla
contemporanea sensibilizzazione del consumatore verso prodotti naturali, a cui
vengono inevitabilmente associati i concetti di “salutare” e “benefico”, ha
recentemente aperto le porte alla produzione di vanillina per via biotecnologia.
I prodotti ottenuti mediante catalizzatori naturali (microrganismi, cellule
eucariotiche o enzimi) possono essere infatti classificati come “naturali” secondo
la legislazione statunitense ed europea, inoltre risultano privi delle impurità che
invece si riscontrano in quelli sintetizzati per via chimica, e per tale motivo
maggiormente caratterizzati dal punto di vista delle proprietà organolettiche.
Non solo: l’Unione Europea dovrebbe approvare a breve la Proposta del
Parlamento Europeo e del Consiglio del 28/07/2006 [7] che impedirà di
etichettare come naturali gli aromi ottenuti per via chimica, finora classificati
come natural identical e pertanto indicati semplicemente come naturali sulle
confezioni dei prodotti destinati al consumatore. Ciò renderà ancora più
interessante e competitiva la produzione di vanillina a partire da microrganismi:
si prevede infatti un incremento della richiesta di questo prodotto soprattutto da
parte di aziende particolarmente attente agli aspetti di salute e benessere derivanti
dal consumo di alimenti il più possibile non trattati e quindi considerati
“genuini”.
Ulteriori fattori che rendono la biovanillina una valida alternativa al prodotto
estratto da Vanilla sono la competitività sul mercato, (attualmente il costo della
vanillina industriale biotecnologica Rhovanil® Natural prodotta tramite
Introduzione
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l’impiego di batteri streptomiceti si aggira attorno ai 700 $/kg, ovvero 500 €/kg
[8]), e l’indipendenza da possibili carenze causate da problemi locali (clima,
pesticidi, fertilizzanti, ecc…). Dal punto di vista scientifico poi la biocatalisi
permette di operare in condizioni blande, proteggendo così reagenti e prodotti
instabili; non solo, grazie alla selettività degli enzimi è possibile ottenere un
prodotto dotato di caratteristiche funzionali ad alta specificità.
Scopo di questa tesi è effettuare il dimensionamento di massima di un impianto
industriale per la produzione di vanillina mediante bioconversione di acido
ferulico ad opera di Pseudomonas fluorescens BF13-1p e quindi valutare il costo
di produzione di tale prodotto allo scopo di verificare la convenienza economica
del processo, nell’ottica di una sua futura effettiva realizzazione.
Introduzione
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Capitolo 2
Produzione di vanillina
In questo capitolo verranno dapprima illustrati i meccanismi biochimici di sintesi
della vanillina sia in Vanilla che nei microrganismi impiegati in ambito
biotecnologico; in seguito verranno descritti in dettaglio i processi produttivi di
interesse per il mercato mondiale già citati nel capitolo precedente: produzione
naturale, sintesi chimica e produzione biotecnologica.
2.1 Biosintesi della vanillina
2.1.1 Biosintesi in Vanilla
Sono numerosissimi gli studi che hanno tentato di spiegare il naturale processo di
biosintesi della vanillina caratteristico delle orchidacee del genere Vanilla,
tuttavia permangono ancora alcune incertezze.
Secondo i primi modelli proposti [8] la vanillina deriva dall’ossidazione del
coniferoside a vanilloside e dalla successiva idrolisi acida di quest’ultimo.
Più recentemente è stata proposta una diversa tesi [9], in base a cui la sintesi
avviene a partire da acido ferulico, soggetto ad una β-ossidazione con formazione
di vanilloil-CoA, composto che viene ridotto a vanillina o alternativamente
deacilato ad acido vanillico.
Tuttavia sembra che esista una via più complessa [10, 11, 12] a partire dall’acido
caffeico, che viene metilato in posizione 4 generando l’acido isoferulico, questo è
12
a sua volta metilato in posizione 3 con formazione di acido dimetossicinnamico
che subisce demetilazione in posizione 4 e successiva glicosilazione. Più tardi si
verifica il taglio della catena laterale con produzione di acido vanillico,
successivamente ridotto a vanillina.
2.1.2. Biosintesi a partire da microrganismi
Gli studi riguardanti la biosintesi di vanillina hanno dimostrato la capacità di
molteplici microrganismi di produrre tale molecola a partire da substrati di
diversa natura. Tra questi riveste particolare importanza l’acido ferulico, un
derivato estremamente abbondante in natura dell’acido cinnamico, situato nella
parete cellulare del legno, dell’erba, della crusca di grano e mais e di molti
cereali, come il riso [13], oltre che in alcuni scarti agroalimentari (quali le acque
di vegetazione), in quantità piuttosto significative. La sua estrazione avviene
mediante trattamenti enzimatici specifici, rendendolo un substrato di facile
reperibilità e costi limitati.
L’acido ferulico viene convertito in vanillina in funghi, batteri e lieviti, attraverso
quattro diverse vie metaboliche, proposte di seguito.
1) Decarbossilazione non- ossidativa. Tale meccanismo, osservato in lieviti e
funghi, prevede il passaggio da acido ferulico a 4-vinilguaiacolo (4-idrossi-3-
metossistirene), attraverso un’isomerizzazione enzimatica ad un intermedio
chinoide che subisce decarbossilazione spontanea [14]. In alcuni microrganismi,
ad esempio alcuni lieviti e Bacillus coagulans [15], si osserva la formazione di
vanillina da 4-vinilguaiacolo, tuttavia tale reazione non è chiara. L’enzima che
catalizza la decarbossilazione iniziale è stato isolato in Pseudomonas fluorescens
[16], clonato ed espresso in Escherichia coli.
Produzione di vanillina
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2) Riduzione della catena laterale. Questa via avviene tipicamente in
condizioni anaerobiche (è stata tuttavia osservata anche in presenza di ossigeno).
Essa prevede la formazione di acido 4-idrossi-3-metossifenilpropionico (acido
diidroferulico) catabolizzato in seguito ad acido omovanillico, p-
carbossimetilfenolo e acido vanillico. Come nel caso precedente si forma un
intermedio chinonico che viene ridotto. Tra gli altri è stata riscontrata in
Wolinella succinogenes [17], Burkholderia cepacia [18], Lactobacillus
plantarum [19].
Fig. 2.1: decarbossilazione (A) e conversione riduttiva (B) dell’acido ferulico [20].
3) Deacetilazione indipendente dal coenzima A (CoA). Un gruppo acetato
viene eliminato dalla catena laterale dell’acido ferulico, con produzione di
vanillina; tale meccanismo è stato osservato ad esempio in Bacillus subtilis [21].
Produzione di vanillina
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4) Deacetilazione dipendente dal coenzima A (CoA). L’acido ferulico viene
trasformato in tioestere del coenzima A (feruloil-CoA), questo è idratato non
ossidativamente e scomposto in vanillina e acetil-CoA; entrambe le reazioni sono
catalizzate dall’enzima 4-idrossicinnamoil-CoA idratasi/liasi (HCHL). I geni
corrispondenti a tale enzima in P. fluorescens sono stati clonati ed espressi in E.
coli [22], il quale è stato reso in grado di convertire acido ferulico a vanillina.
Fig. 2.2: deacetilazione senza intervento del coenzima A (C) e con intervento del coenzima A (D).
A causa della sua notevole reattività la vanillina risulta tossica per le cellule [23];
pertanto essa viene generalmente ridotta ad alcol vanillico oppure ossidata ad
acido vanillico (in numerosi microrganismi si ritrovano delle “vanillina-
Produzione di vanillina
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