Analisi delle aberrazioni indotte da variazioni di indice di rifrazione

Introduzione Introduzione La microscopia ottica si pone da sempre come una tecnica di largo utilizzo nella ricerca in ambito biofisico, data la versatilità con cui permette lo studio dei campioni nelle loro condizioni fisiologiche. L’analisi dei sistemi biologici, la cui struttura è intrinsecamente tridimensionale, richiede strumenti in grado di compiere un’accurata indagine della loro distribuzione spaziale. Questo risulta il più delle volte essenziale visto il complesso e delicato legame tra struttura e funzione; tale esigenza non trova, di fatto, completo riscontro nelle possibilità della microscopia convenzionale. I notevoli miglioramenti tecnologici di cui hanno usufruito negli ultimi anni alcune tecniche di microscopia ottica, e in particolare quelle in fluorescenza, hanno portato alla possibilità di analisi 3D di sistemi cellulari e subcellulari mediante la tecnica del sezionamento ottico realizzato in modo particolarmente efficace nella Microscopia Confocale a Scansione Laser (CLSM, Confocal Laser Scanning Microscopy). Un comune microscopio ottico non è di per sé predisposto per uno studio accurato di oggetti tridimensionali, in quanto esso fornisce generalmente una immagine bidimensionale, che consiste nella sovrapposizione di regioni del campione a fuoco e fuori fuoco. Il principio su cui si basa la microscopia confocale consiste, viceversa, nell’illuminazione selettiva, ‘punto per punto’ e nell’acquisizione (in riflessione o fluorescenza) della sola luce proveniente dalla zona illuminato. Attraverso una scansione del campione lungo l’asse ottico (sezionamento ottico) è poi possibile ricostruire al calcolatore l’intera struttura tridimensionale, così come essa appare in condizioni fisiologiche. Le problematiche affrontate nell’ambito di questo lavoro di tesi sono prevalentemente legate allo studio degli effetti che la variazione dell’indice di rifrazione del mezzo d’immersione del campione rispetto a quello d’immersione dell’obbiettivo produce sui procedimenti di imaging condotti attraverso un’architettura confocale. L’importanza di un’analisi sperimentale di questo tipo risiede soprattutto nella difficoltà di approntare un modello teorico che renda agevolmente conto di tale fenomeno nel campo della microscopia ottica a fluorescenza ad uno o più fotoni. Si vuole cercare di fornire un quadro organico dei diversi risvolti che questa problematica ha sulle prestazioni del sistema come formatore di immagini tridimensionali, sia descrivendone il progressivo deteriorarsi in termini di risposta all’impulso (PSF, point spread function), sia attraverso l’indagine morfometrica di campioni fluorescenti opportunamente scelti. Ciò permetterà, da un lato di giungere ad una stima del potere risolutivo dello strumento nelle effettive condizioni sperimentali, dall’altro di disporre dell’andamento sperimentale della PSF, utile ai fini di implementare eventuali algoritmi di deconvoluzione. Ogni particolare assetto operativo del sistema verrà inizialmente indagato impiegando oggetti di forma e dimensioni note, attraverso i quali valutare gli effetti introdotti dalle diverse aberrazioni presenti. I risultati così ottenuti verranno, in un secondo tempo, confrontati con quelli ottenuti, in identiche condizioni, dall’analisi di un preparato biologico ed utilizzati per trarre da esso informazioni di tipo essenzialmente morfometrico. Si proveranno altresì a suggerire, nei casi esaminati, alcuni pratici accorgimenti attraverso i quali minimizzare gli effetti del mismatch o, dove ciò non sia possibile per la particolare natura del campione, attraverso i quali tenere conto dei necessari fattori correttivi per un’accurata analisi quantitativa di distanze, superfici, volumi.