Analisi filogenetica di norovirus responsabili di enterite sporadica infantile

La gastroenterite virale è un’infiammazione dell’apparato digerente che può essere causata da diversi virus e si manifesta con nausea, dolori addominali, diarrea e vomito. Questi ultimi sintomi possono causare un’ingente e rapida perdita di acqua, elettroliti e minerali. Nell’adulto l’evoluzione è benigna, ma i lattanti e i bambini sono soggetti alle complicanze, talora gravi, della disidratazione e necessitano spesso del ricovero in ospedale. Nei paesi in via di sviluppo la gastroenterite rappresenta un’importante causa di mortalità infantile.
I Norovirus (NoV) sono la causa più comune di epidemie di gastroenterite acuta in tutto il mondo e in tutte le fasce d’età e sono classificati come agenti microbici di categoria B dal National Institute of Allergy and Infectious Diseases, in quanto altamente contagiosi, estremamente stabili, e altamente infettanti. Molti aspetti della fisiopatologia delle infezioni da NoV umani risultano ancora non chiari, a causa della mancanza di un sistema di coltura cellulare o di un modello animale. I NoV appartengono alla famiglia Caliciviridae e sono virus non inviluppati, con un genoma a RNA a singolo filamento a polarità positiva. Il genoma dei NoV presenta tre ordini di lettura (ORF): il primo ORF codifica per proteine coinvolte nella replicazione virale, il secondo ORF per la proteina VP1 e il terzo ORF per la proteina VP2. VP1 è responsabile del legame del virus ai suoi recettori cellulari (ABO, H, antigene di Lewis), e in base all’analisi filogenetica di questo gene è stato possibile sviluppare un sistema di classificazione che prevede 5 diversi genogruppi (da GI a GV); ulteriormente suddivisi in 33 cluster genetici o genotipi. I NoV che infettano l’uomo appartengono ai genogruppi I, II e IV. Il genotipo 4 del genogruppo II (GII.4) provoca la maggior parte delle epidemie di vomito invernale e mostra una peculiare capacità di andare incontro a frequenti cambiamenti genetici, determinando la comparsa di “varianti”. Ad oggi non esiste ancora un vaccino specifico per i NoV. L’utilizzo di particelle virus-like (VLP), antigenicamente e morfologicamente simili al virione nativo, sembra una strategia promettente per indurre una risposta immunitaria protettiva. L’obiettivo del nostro studio è stato quello di comprendere le dinamiche evolutive dei NoV attraverso la caratterizzazione molecolare dei ceppi circolanti a Palermo nel corso di 15 mesi.
Un totale di 596 campioni fecali di bambini di età <5 anni ricoverati presso l’Ospedale “G. Di Cristina” di Palermo sono stati raccolti nell’anno 2011 e nel primo trimestre del 2012. L’RNA virale è stato estratto, utilizzando il QIAmp Viral RNA Mini Kit (Qiagen), e retrotrascritto in cDNA. Il cDNA ottenuto è stato utilizzato per identificare la presenza del genoma di NoV mediante una reazione di Real-Time PCR. I campioni positivi in Real-Time PCR sono stati tipizzati tramite amplificazione e sequenziamento di ORF1 e ORF2. Infatti, l’analisi del gene RdRp, affiancata dall’analisi del gene del capside, è la migliore strategia per determinare genotipi e varianti di NoV. La determinazione del genotipo di appartenenza di ognuna delle sequenze geniche ottenute è stata effettuata tramite la banca dati della rete di sorveglianza europea Noronet. L’identificazione presuntiva così ottenuta è stata verificata attraverso un’analisi filogenetica.


Già nel passato la circolazione di NoV era stata indagata a Palermo. Nel 2004 i NoV erano stati riconosciuti come i più frequenti agenti di enterite virale in bambini ricoverati presso lo stesso ospedale oggetto del nostro studio e dimostrando inoltre la possibile coinfezione NoV-Rotavirus (Colomba et al., 2007). Negli anni 2005 e 2006, la prevalenza dell’infezione da NoV era stata del 15,8% e 28,9%, rispettivamente (Ramirez et al., 2009). Negli anni 2009-2010 sono stati identificati a Palermo ceppi ricombinanti GII.g/GII.12 (Giammanco et al., 2012).


Durante il periodo di sorveglianza è stata riscontrata la presenza di NoV in 140 campioni fecali su 596 esaminati (23,5%). La tipizzazione molecolare ha permesso di individuare la prevalente circolazione del genotipo GII.4 (75,6%), che includeva 4 ceppi con il genotipo ricombinante RdRp/VP1 GII.e/GII.4. Il GII.6 rappresentava il secondo genotipo (9,8%), seguito da GII.2 (7,3%), GI.4 (4,9%) e GII.7 (2,4%). All’interno del genotipo GII.4, la variante v2010 si mostrava prevalente ma era possibile evidenziare la presenza di tre distinti cluster di NoV GII.4 circolanti a partire dal 2011, per i quali è stata ipotizzata l’appartenenza a nuove varianti. Questo risultato è stato confermato dalla presenza di peculiari mutazioni puntiformi e dal calcolo delle percentuali di divergenza nucleotidica rispetto alle sequenze delle varianti GII.4 precedenti.