Metodiche di isolamento e di caratterizzazione di batteri probiotici in latte e derivati

I probiotici vengono definiti come “microrganismi vivi” che apportano beneficio per la salute del consumatore. Gli effetti benefici sono stati raggiunti attraverso la modulazione della attività della flora intestinale, attraverso l’influenza sulle immunità delle mucose mediante l'alterazione di specifiche attività enzimatiche. Molti generi e specie di batteri vengono usati in commercio come probiotici per le applicazioni, più comuni, specialmente le specie Lactobacillus e Bifidobacterium. Tuttavia, molti studi hanno evidenziato imprecisioni riguardo l’etichettatura delle specie contenute all’interno di prodotti probiotici in vendita.

I cambiamenti nel corso degli ultimi dieci anni nella tassonomia di specie probiotiche (Klein et al., 1998), l’applicazione da parte dei produttori alimentari di metodologie di conservazione sbagliate e forse la percezione di un vantaggio di una diversa etichettatura per alcune specie rispetto ad altre (ad esempio, un migliore nome di riconoscimento) hanno probabilmente contribuito a nomi di specie inesatte sulle etichette commerciali dei prodotti probiotici. E’ importante che l'etichettatura venga eseguita in maniera responsabile, per non deludere la fiducia dei consumatori e per questioni di sicurezza alimentare. Per esempio, è stata accertata la presenza di livelli significativi di popolazioni di Enterococcus non riportati su prodotti probiotici commerciali (Hamilton-Miller et al., 1996, 1999), alcuni enterococchi potenzialmente opportunisti, ad attività emolitica, e con una certa resistenza agli antibiotici trasferibile (Salminen e von Wright, 1998). Anche se la sicurezza non può essere compromessa se ceppi del genere Lactobacillus sono erroneamente specificati all’interno di una matrice alimentare, spetta ai produttori analizzare e caratterizzare accuratamente i prodotti alimentari per i consumatori.

Come per i batteri in generale, l'analisi delle sequenze della Small unit dell’rDNA 16S è stata applicata con successo anche per la caratterizzazione di lactobacilli e bifidobacteria (Tannock, 1999).
Sono stati sviluppati metodi rapidi come, per esempio, sonde speciali costituite ah hoc per tre specie del gruppo "L.acidophilus" (Pot et al., 1993) e primer specie-specifici per Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus helveticus (Tilsala-Timisjarvi e Alatossava, 1997), e Lactobacillus plantarum (Quéré et al., 1997). Utilizzando la metodica RFLP (Giraffa et al., 1998) è riuscito ad individuare e differenziare L. delbrueckii, L. helveticus, e L. acidophilus, tuttavia non e’ riuscito a differenziare le sottospecie lactis e delbrueckii di L. delbrueckii.

Analizzando la complessità della situazione di mercato attuale, l'identificazione dei microrganismi è diventata necessaria per il consumatore e per un responsabile scientifico, ed è nata così una nuova branca che si occupa dei caratteri economici e legislativi della microbiologia. Si tratta di un fatto ben noto che la specie, e persino genere e denominazione, possono dare un forte indizio circa l’habitat tipico del microrganismo e la sua possibile origine.

Inoltre, come indicato sopra, grazie all’utilizzo di tecniche speciali di biologia molecolare, una specie, e in particolare dei "nuovi" ceppi, possono essere individuati e classificati.

I ceppi selezionati a seconda delle proprie caratteristiche, devono essere selezionati e ne deve essere indicata la quantità limite all’interno delle matrici alimentari. Con la stessa tecnica, è possibile selezionare e caratterizzare ceppi all’interno di tutti i prodotti provenienti dalla fermentazione del latte, dato che gli organi legislativi e gli enti certificatori richiedono precise indicazioni delle proprietà all’interno dei prodotti alimentari.

Facendo riferimento ai recenti sviluppi riguardanti il miglioramento della qualità della dieta, lo scopo della presente ricerca è stato quello di verificare l’effettiva presenza di probiotici in latti fermentati reperibili sul mercato. Per il raggiungimento di tale obiettivo ci si è avvalsi, di test di biologia molecolare.

Questo lavoro di Tesi riassume il più importante ed efficace di questi metodi, la metodica di analisi di specie batteriche presenti all’interno di derivati del latte, al fine di legittimare la presenza dei lattobacilli o di altri microrganismi all’interno delle rispettive matrici alimentari, mediante la metodica di “Small-subunit 16S rRNA (SSU) fragment gene PCR amplification and following sequencing”, cioe’ amplificazione mediante PCR della subunita’ minore del rDNA 16S (SSU) e successiva analisi di sequenza dei frammenti genici ottenuti” delineando in maniera approfondita gli step sperimentali utilizzati per l’analisi.