Messa a punto di metodi diagnostici in real time PCR per malattie delle piante da Oomiceti del genere Phytophthora

Organismi del genere Phytophthora, presenti in habitat terrestri e acquatici, sono noti per essere i principali patogeni che vanno a colpire le radici deputate all’assorbimento delle sostanze nutritive e responsabili di marciumi del colletto di numerose piante (Moralejo et al., 2009).
Tra gli strumenti diagnostici sviluppati in patologia vegetale, la real-time PCR è risultata essere un metodo efficace in grado di rilevare e quantificare le specie di Phytophthora in ambienti diversi.
In questa tesi è stata messa a punto una metodica in real time PCR, utilizzando la chimica SYBR Green, per rilevare e quantificare alcune specie di Phytophthora in diverse matrici (tessuti vegetali, suolo ed acqua) ed in diversi ambiti: P. cactorum e cinnamomi in ambiente vivaistico; P. cambivora in bosco su piante di castagno; Phytophthora spp. su ippocastano in ambito urbano.
Sono stati raccolti campioni di corteccia da piante di castagno sintomatiche (Castanea sativa) infette da P. cambivora e da piante di ippocastano con sintomi provocati da Phytophthora spp. e campioni di suolo in castagneto. In laboratorio sono stati preparati campioni di terreno sterilizzato inoculati con P. cambivora, campioni di acqua sterilizzata inoculati con P. cinnamomi e P. cactorum e piantine di Vicia faba inoculate con P. cinnamomi e P. cactorum.
Il DNA è stato estratto da micelio fungino, materiale vegetale e acqua come descritto da Luchi et al. (2005). Il DNA dai campioni di suolo è stato estratto utilizzando FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals) seguendo le istruzioni del produttore.
La metodica in real time PCR è stata sviluppata utilizzando dei primers descritti da Schena et al. (2008). Primer specifici sono stati utilizzati per rilevare P. cambivora, mentre le altre specie sono state rilevate utilizzando primers generici. La loro specificità è stata dapprima testata su DNA estratto da colture pure di Phytophthora spp. e Pythium.
Utilizzando primers specifici con la real time PCR, è stato possibile rilevare la presenza di P. cambivora nei tessuti di castagno e nel suolo inoculato con P. cambivora. Il DNA di P. cambivora è stato rilevato nei campioni di corteccia dopo una nested PCR. Mentre dai campioni di suolo presi in castagneto non è risultata la presenza di P. cambivora.
La sensibilità del metodo durante la fase iniziale della colonizzazione è stata evidenziata rilevando il DNA di P. cinnamomi e P. cactorum in semenzali di fava dopo 3, 5 e 10 dall'inoculazione. Il DNA dei patogeni è stato quantificato e varia da 103 a 104 pg/g. E 'stato anche possibile rilevare la presenza e quantificare il DNA di P. cactorum e P. cinnamomi in acqua (102 pg/g e 103 pg/g rispettivamente). Mentre dai tessuti di ippocastano non è stata rilevata la presenza di Phytophthora spp.
La sensibilità e la specificità della real time PCR sono state confermate anche in piante infette, acqua e suolo, mostrando la sua capacità di rilevare piccole quantità di DNA di Phytophthora da differenti campioni.