Dosaggio di Endocannabinoidi Plasmatici mediante Cromatografia Liquida abbinata a Spettrometria di Massa Tandem (LC-MS/MS): confronto fra una popolazione normale e una popolazione affetta da obesità

L’innovazione della LC-MS/MS è rappresentato dall’aver unito la versatilità della cromatografia liquida con l’elevata sensibilità e specificità dello spettrometro di massa a triplo quadrupolo. Per accoppiare questi due strumenti si è dovuto principalmente risolvere il grosso problema nell’interfacciarli poiché è necessario rimuovere il solvente (le fasi mobili) in cui è disciolto il campione prima che quest’ultimo giunga allo spettrometro. La cromatografia liquida infatti lavora con grandi volumi di solvente ad alta pressione, mentre il sistema spettrometrico lavora in alto vuoto: quindi a questo livello il campione deve essere necessariamente in forma gassosa per poter accedere all’interno dello spettrometro ed essere attratto dal campo elettrico e dal gradiente pressorio. Ciò è stato reso possibile dall’invenzione di John Fenn, l’interfaccia ESI (ionizzazione a pressione atmosferica), che nel 2002 gli permise di ottenere il premio nobel.
Con questa tecnica non ci sono limiti né per la grandezza degli analiti da studiare, né per le loro caratteristiche chimiche; è una tecnica multianalitica e fornisce risultati in breve tempo, generando un’alta produttività.
Fino a poco tempo fa, in campo endocrinologico, per quanto riguarda le analisi di laboratorio, era possibile quantificare gli ormoni solamente grazie a metodiche immunologiche, la cui limitazione principale è la specificità. Successivamente si è evoluta la GC-MS, la cui specificità è molto più alta rispetto alle metodiche immunologiche. Con essa è stato possibile sviluppare diversi metodi di quantificazione, soprattutto nel caso degli steroidi e degli ormoni tiroidei, tuttavia la preparazione dei campioni risulta spesso laboriosa, come precedentemente detto. L’avvento della LC-MS/MS ha facilitato o permesso l’analisi di un’ampia gamma di molecole, da quelle sugli steroidi a quelle sulle catecolamine, grazie alla sua facilità e versatilità d’uso. Tutto ciò sia in ambito di ricerca, sia in campo diagnostico, dove questa tecnica permette di ottenere risultati migliori grazie alla sua maggiore specificità e sensibilità. Questo vale soprattutto per le analisi di ormoni steroidei, tiroidei e altri ormoni correlati, come la 25-idrossi-vitamina D3. Vale meno nel caso degli ormoni proteici, la cui generalmente bassissima concentrazione e variabilità, dovuta a polimorfismi o mutazioni, rende difficile la quantificazione. Sono invece più proponibili analisi di quantificazione su ormoni peptidici, data la loro minore possibilità di variare (Cabaleiro et al.2006; Rogatsky et al. 2006).
Per quanto riguarda la ricerca sul sistema endocannabinoide, prima dell’avvento della tecnica LC-MS/MS, le analisi quantitative venivano svolte con altre tecniche, quali la GC/MS (H.Y.T. Yang et al. 1999), che richiedeva, in quel caso, almeno due passaggi di derivatizzazione.
Con lo sviluppo della tecnica LC-MS/MS, accelerato anche dalla forte necessità di studiare il coinvolgimento del sistema endocannabinoide nell’obesità, sono stati sviluppati diversi tipi di metodi per l’analisi degli endocannabinoidi, alcuni in grado di separarne e quantificarne cinque (A. Thomas et al. 2008), altri capaci di analizzare fino a dodici endocannabinoidi nello stesso campione (Balvers et al. 2009)
Del resto questa tecnica è l’unica al momento in grado di permettere una misurazione efficiente degli endocannabinoidi, in quanto gode della sensibilità e specificità indispensabili per la quantificazione di questi lipidi instabili in matrici quali plasma, liquor o tessuti, dove sono presenti in concentrazioni molto basse. L’interesse per queste molecole è centrato in buona parte sui recenti studi che hanno correlato un aumento degli endocannabinoidi circolanti e tissutali (ad esempio ipotalamo e tessuto adiposo) con l’obesità, ma sono necessari studi con un numero di soggetti statisticamente rilevante, finora non svolti.