Clonaggio, espressione e purificazione del dominio NBD1 della proteina codificata dal gene ABCC6 umano

La tesi ha riguardato studi preliminari, strutturali e funzionali, sul dominio NBD1 legante ATP della proteina codificata dal gene ABCC6 umano, le cui mutazioni sono coinvolte nello sviluppo dello Pseudoxanthoma elasticum, patologia autosomica recessiva che induce calcificazione di pelle, retina e tessuti cardiovascolari. Si è preliminarmente clonata la sequenza del gene ABCC6 codificante per il dominio d’interesse in due vettori d’espressione e, in particolare, si è espresso il peptide in fusione con la proteina glutatione-S-transferasi (GST). In seguito si sono tentate diverse metodiche di purificazione quali cromatografia di affinità, HPLC, gel filtrazione ed SDS-PAGE: quest’ultima si è rivelata la tecnica più efficiente, previa digestione della proteina di fusione con proteasi. Studi di dicroismo circolare hanno permesso di dedurre che il peptide in questione si struttura in ambiente acquoso e adotta una conformazione mista ad α-elica e foglietto-β, mentre studi di FRET hanno permesso di dedurre che interagisce con l’ATP e con l’ADP con differenti affinità.