Stabilità conformazionale di alcuni mutanti del monomero della ribonucleasi seminale bovina

La RNasi-BS è l’unica ribonucleasi, dimerica a pH fisiologico, tra quelle note finora (D’Alessio et al., 1997). Essa è costituita da due identiche subunità legate da due ponti disolfurici incrociati intercatena tra la cisteina 31 di una subunità e la cisteina 32 dell’altra e viceversa. In soluzione la RNasi-BS assume due conformazioni diverse: La forma MXM, nella quale ogni subunità scambia il suo braccio N-terminale con il suo partner (Mazzarella et al., 1993), e la forma M=M che non presenta lo scambio (Piccoli et al., 1992). Le due isoforme della RNasi-BS in soluzione si interconvertono, raggiungendo il rapporto MXM:M=M di 2:1 (Piccoli et al., 1992). La RNasi-BS presenta attività citotossica nei confronti delle cellule tumorali sia in vitro che in vivo, e si pensa che sia il dimero non covalente (NCD) a presentare attività citotossica nei confronti delle cellule tumorali (Sica et al., 2004). Poiché il dimero NCD si ottiene sempre nella forma scambiata si è cercato di capire quali fossero gli amminoacidi direttamente coinvolti nello scambio dei bracci N-Terminali. A questo scopo è stato espresso il monomero della RNasi-BS e alcuni suoi mutanti P19A m-BS, L28Q m-BS e il doppio mutante P19A/L28Q m-BS. Il mio lavoro di tesi è stato quello di caratterizzare termodinamicamente queste proteine e paragonali alla RNasi-A. Il monomero della RNasi-BS presenta la mutazione N67D, al fine di evitare una reazione di deammidazione spontanea, della catena laterale dell’asparagina, ma che non provoca nessuna variazione funzionale (Piccoli et al., 1988; D’Alessio et al., 1997). Nel mutante P19A m-BS il residuo 19 di prolina è stato sostituito con un residuo di alanina, uguale polarità dei due residui ma diverso ingombro sterico, il residuo 19 della catena è situato nella regione del peptide cerniera, che è quella che disloca durante lo scambio dei bracci N-terminali. Nel mutante L28Q m-BS il residuo di leucina 28 è stato sostituito con uno di glutammina, uguale ingombro sterico dei due residui ma diversa polarità, il residuo 28 è situato nell’interfaccia tra le due subunità. Nel doppio mutante P19A/L28Q m-BS sono presenti entrambe le mutazioni. Le tecniche usate per caratterizzare i campioni sono la microcalorimetria differenziale a scansione e il dicroismo circolare. I dati ottenuti dalle denaturazioni termiche sono stati elaborati ipotizzando una denaturazione a due stati N↔D e i risultati ottenuti hanno confermato questa ipotesi. I parametri termodinamici delle proteine, ottenuti elaborando le denaturazioni termiche sia con il metodo calorimetrico sia con il metodo spettroscopico, sono in ottimo accordo tra di loro e mostrano che relativamente alla RNasi-A tutti i campioni monomerici della RNasi BS siano molto meno stabili, e mostrano che il mutante P19A m-BS sia leggermente più stabile rispetto al monomero m-BS e che sia il mutante L28Q m-BS che il doppio mutante P19A/L28Q m-BS siano leggermente meno stabili rispetto al monomero. Infatti registrando spettri Far-UV di dicroismo circolare, dei campioni monomerici di Ribonucleasi-BS, sono state ottenute curve sovrapponibili, che indicano una grande somiglianza nella struttura secondaria. Dai dati raccolti si può quindi concludere che la prolina situata nella regione cerniera non giochi un ruolo fondamentale nel fenomeno dello scambio di domini della RNasi-BS, ma che possa essere considerata come un sostegno alla realizzazione della struttura quaternaria. I risultati ottenuti dallo studio del mutante L28Q m-BS, mostrano che l’introduzione della glutammina non abbia influenza rilevante né sulla stabilità né sulla struttura e quindi questo fa capire che la leucina possa avere un ruolo importante nel processo di dimerizzazione, perché da altri studi (Ercole et al., 2003) si è visto che partendo dai mutanti L28Q m-BS e da P19A/L28Q m-BS si ottengono rese di dimero (50%), nel processo di dimerizzazione, molto più basse rispetto a quelle che si ottengono quando si parte dal monomero m-BS e dal mutante P19A m-BS (80%), nello stesso processo. Anche nel processo di scambi di domini si è ottenuto lo stesso tipo di risultati, infatti partendo dai mutanti L28Q m-BS si ottiene una percentuale di dimero scambiato minore di circa il 50% (Ercole et al., 2003). Inoltre il comportamento molto simile del mutante L28Q m-BS e del doppio mutante P19A/L28Q m-BS confermano che la prolina non sia un amminoacido chiave né nel processo di dimerizzazione né di scambio di domini.