Sviluppo di un metodo HPLC-DAD e LC-MS/MS per la determinazione di doxiciclina in formulazioni farmaceutiche ad uso veterinario

Le tetracicline sono antibiotici ad azione batteriostatica, caratterizzate dalla presenza di uno stesso gruppo naftacenico variamente sostituito. Possiedono un ampio spettro d’azione che include batteri gram positivi e gram negativi. Vengono classificate in base alla loro durata d’azione che può essere breve (6-8 ore), intermedia (12-14 ore) o lunga (14-16 ore), come la doxiciclina. Anche l’assorbimento varia molto in base al tipo di tetraciclina e alle condizioni in cui viene somministrata. In particolare l’assorbimento delle tetracicline è fortemente limitato dalla presenza di ioni metallici bi- e trivalenti che formano con esse complessi insolubili, proprietà questa che ha creato nel corso degli anni non pochi problemi nell’analisi cromatografica di questi composti.
Il valore delle tetracicline come antibatterici nelle pratiche cliniche è stato fortemente ridotto a causa di due problemi principali: l’insorgenza di ceppi batterici resistenti, conseguenza del largo uso che ne è stato fatto, e gli svariati effetti collaterali.
Oggigiorno la doxiciclina è sempre più usata nelle pratiche cliniche per il trattamento di infiammazioni del cavo orale come le gengiviti, non per le sue proprietà antibatteriche ma piuttosto per la sua capacità di inibire il gruppo di enzimi delle metalloproteinasi matriciali (MMP).
Per quanto riguarda il loro uso veterinario sono al momento disponibili in commercio otto tetracicline, fra cui la doxiciclina, e si suppone che il loro numero crescerà ulteriormente grazie all’ampio spettro d’azione e al basso costo che queste molecole possiedono.
La UE ha stabilito i limiti massimi per i residui di sostanze derivanti da tetracicline in vari tessuti animali: 0.6 ppm nel rene, 0.3 nel fegato, 0.2 nelle uova, 0.1 nel muscolo e nel latte; questi valori comprendono la sostanza principale e il 4-epimero nel caso di oxitetraciclina, tetraciclina e clortetraciclina. Il monitoraggio di queste sostanze, ad esempio da parte del servizio di salute pubblica, è uno dei motivi per cui è necessario disporre di metodi di quantificazione precisi.
Inoltre le tetracicline mostrano una scarsa stabilità e le preparazioni farmaceutiche possono contenere piccole quantità di impurezze generate durante la sintesi a seguito di processi di deidrogenazione o epimerizzazione durante l’immagazzinamento.
Questo studio si propone di offrire un valido contributo nel controllo di qualità della doxiciclina e della sua determinazione in mangimi animali mediante HPLC; in particolare gli obiettivi della presente tesi sono stati lo sviluppo di un metodo HPLC basato su una nuova fase stazionaria polare adatta a separare la doxiciclina dalla 6-epidoxiciclina e dalla metaciclina, l’identificazione delle due impurezze (metaciclina e 6-epidoxiciclina) mediante una tecnica LC-ESI-MS e la determinazione della doxiciclina e delle impurezze correlate contenute in formulazioni farmaceutiche ad uso veterinario (Doxipan DPS).
Per quanto riguarda la separazione delle impurezze l’analisi cromatografica HPLC è stata eseguita su una colonna Phenomenex Luna C18 e su una Phenomenex Synergi 4m Polar-RP utilizzando fasi mobili sia acide (pH 2.5) che basiche (pH 8.0).
L’uso della fase stazionaria Synergi 4m Polar-RP e della fase mobile composta da acido ossalico (0.02 M; pH 2.5)/acetonitrile 82:18 (v/v) ha permesso la completa separazione di metaciclina, 6-epidoxiciclina e doxiciclina. La stessa separazione è stata ottenuta anche utilizzando la colonna Luna C18 e la fase mobile a pH 8.
Le analisi LC-ESI-MS e MS/MS, sia in polarità positiva che in negativa, sono state utilizzate per ottenere gli spettri di massa e quindi la conferma delle identità degli analiti.
Per la determinazione della doxiciclina nella formulazione farmaceutica ad uso veterinario è stato convalidato il metodo basato sull’uso della colonna Luna C18 abbinata ad una rivelazione UV a 346 nm e ad una fase mobile composta da acido ossalico 0.02 M (pH 2.5) / acetonitrile / metanolo 75:17:8 (v/v). Il campione Doxipan DPS è stato trattato prima dell’iniezione con acqua acida sotto agitazione e riscaldamento al fine di estrarre quantitativamente il principio attivo. Successivamente la miscela acida è stata filtrata con filtri da siringa (0.2 m) e la soluzione limpida utilizzata per l’analisi HPLC.
E’ stata ottenuta una buona linearità sia per l’analisi del principio attivo isolato (r2=0.9978) che della forma farmaceutica ricostituita (r2=0.9979). Inoltre le due rette sono risultate sovrapponibili e ciò indica che il farmaco viene estratto dalla formulazione con unrecupero quantitativo utilizzando il metodo proposto. L’accuratezza, la ripetibilità, la riproducibilità e la selettività rispetto alle sostanze correlate sono risultate soddisfacenti. I limiti di rivelabilità (0.00212 mg/mL) e quantificazione (0.00645 mg/mL) sono risultati adeguati al tipo di analisi. Inoltre è stata valutata la degradazione fotoindotta e termoindotta.