Strategie di codificazione del genoma: classe I DNA a doppio filamento e classe II a singolo filamento

Strategie di codificazione del genoma:  classe I DNA a doppio filamento  e classe II a singolo filamento

Conoscere la differenza tra virus a DNA ed a RNA con le rispettive eccezioni è importante. Iniziamo quindi ad analizzare le varie strategie che adottano i virus a DNA per poter replicare e produrre i virioni di progenie. Dopo la fase di adsorbimento e la fase di penetrazione, tutti i virus a DNA replicano nel nucleo (eccezione i poxvirus) Il genoma di questi virus deve quindi penetrare anche nel nucleo. In questo compartimento il genoma si esprime e trascrive degli RNA messaggeri, sintesi operata dalla RNA polimerasi II della cellula. Questi RNA, una volta sintetizzati nel nucleo, vanno nel citoplasma dove si legano ai ribosomi (cosa che implica la presenza di un cap e di una coda di poly-A terminale). Le informazioni contenute negli mRNA serviranno quindi per la sintesi delle proteine virali che vengono sintetizzate a livello del citoplasma; se il virus è però a replicazione nucleare, le proteine sintetizzate nel citoplasma migreranno nuovamente nel nucleo. Fra le varie proteine che vengono sintetizzate abbiamo generalmente proteine che servono per la replicazione del genoma del virus, come la DNA polimerasi che serve per la replicazione del proprio genoma, e proteine strutturali che, migrando nel nucleo, si assemblano per riformare la struttura del virus che verrà riempita dai genomi che si sono intanto replicati; in questo modo si formano i virioni di progenie. Bisogna fare la differenza tra un virus a DNA nudo ed un virus con involucro. Un virus nudo viene rilasciato per lisi, mentre in un virus con involucro, i nucleocapsidi possono essere rilasciati sia dal nucleo attraverso vescicole (che costituiranno l'involucro) sia a livello della membrana citoplasmatica, dove acquisteranno da essa l'involucro. I virus a DNA, nella loro replicazione nucleare, hanno dei vantaggi, in quanto possono usare molti degli enzimi cellulari e nucleari per la trascrizione, come la RNA polimerasi II, che serve per la sintesi degli mRNA, come proteine attivatorie e coattivatorie (fattori trascrizionali che facilitano la trascrizione) ed enzimi per la sintesi del cap e per la coda di poly-A. I virus possono inoltre usare anche i meccanismi dello splicing (anche se solo alcuni virus lo subiscono). In generale un problema per questi virus a DNA è proprio la penetrazione nel nucleo avendo un capside o un nucleocapside. Il capside è la struttura di un virus senza involucro mentre il nucleocapside è la struttura interna di un virus che possiede anche un involucro. Questi capsidi o nucleocapsidi possono raggiungere la membrana nucleare solo se hanno presenti nelle loro strutture sequenze NLS (sequenze di localizzazione nucleare). Quando però i virus arrivano nel poro nucleare, di 20-26 nm di diametro, non possono entrare direttamente, ad eccezione dei parvovirus. Infatti quest'ultimi essendo molto piccoli, la sequenza NLS si lega infatti ai recettori dei pori nucleari (carioferine o importine) che permettono l’entrata diretta del virus nel nucleo, dove avviene la spoliazione. In altri virus più grandi, come negli adenovirus, si ha il legame del capside a livello del poro. Qui il capside subisce un uncoating, che determina il rilascio del DNA che penetra nel nucleo: il DNA viene quindi iniettato nel nucleoplasma. Per gli adenovirus si è visto inoltre che il DNA, per complessarsi, si lega agli istoni cellulari.
Come sappiamo, i virus a DNA possono avere un DNA lineare a singolo filamento o a doppio filamento. Il DNA a singolo filamento è tipico solo dei parvovirus mentre il DNA a doppio filamento lineare lo hanno i poxvirus, gli adenovirus e gli herpesvirus. DNA circolare a doppio filamento lo hanno i poliomavirus e i papillomavirus (famiglia papovavirus) e gli hepadnavirus (virus dell'epatite B che hanno replicazione sia nucleare che citoplasmatica). Questi virus hanno tutti una replicazione nucleare. L'eccezione è quella dei poxvirus che hanno una replicazione citoplasmatica. La replicazione del DNA è una replicazione semiconservativa con vari intermedi. Gli adenovirus, insieme agli herpesvirus e ai poxvirus, codificano per la propria DNA polimerasi virale che replica più velocemente ma con più errori. Gli altri virus a DNA (parvovirus, papillomavirus e poliomavirus) usano invece la DNA pol cellulare. La replicazione del DNA inizia sempre da regione dette ORI. Queste regioni sono caratterizzate da siti di riconoscimento per proteine specifiche che sono proteine fondamentali che servono per aprire una bolla di replicazione; queste sequenze palindrome sono caratterizzate inoltre da avere molte basi AT, che facilitano lo srotolamento del DNA. Vicino alle sequenze ORI esistono sequenze di legame per i fattori trascrizionali che servono per aumentare l'efficienza della trascrizione e della replicazione.
La trascrizione normalmente è fatta dalla RNA polimerasi II della cellula e, per vari virus, esistono certe proteine che facilitano la trascrizione, proteine virali che spesso interagiscono con proteine cellulari per formare dei complessi che promuovono la trascrizione dei genomi virali. I virus hanno sempre la necessità di economizzare l'informazione genetica, quindi i genomi dei virus si dicono compatti, nel senso che sono in grado di sintetizzare mRNA su entrambe le eliche di DNA, presupponendo che la trascrizione vada in sensi opposti, come nel caso di un poliomavirus, SV40. Si usano quindi entrambe le eliche e spesso utilizzano anche un altro meccanismo, l'avere degli ORF diversi nello stesso gene che permettono di sintetizzare più proteine diverse. Altro meccanismo poco usato è quello dello splicing alternativo, per formare proteine leggermene diverse, negli adenovirus e da qualche proteina degli herpesvirus. Normalmente tutti gli RNA dei virus hanno cap e coda di poly-A formati dagli enzimi cellulari. La trascrizione avviene sempre nel nucleo eccetto per il poxvirus. Una caratteristica della trascrizione dei virus a DNA è che la trascrizione ha un'organizzazione temporale. I primi trascritti di solito sono proteine enzimatiche dette precoci, che svolgono alcuni processi come la replicazione del genoma del virus, quindi proteine non strutturali. La loro sintesi permette la replicazione del DNA del genoma del virus e, solo dopo, abbiamo la trascrizione dei geni tardivi. La trascrizione dei geni precoci usa come stampo il DNA del virus penetrato, quindi vi saranno poche copie di trascritti; una volta che però si è avuta la replicazione del DNA virale, avremo una maggiore e più rilevante trascrizione di geni tardivi, che porteranno alla formazione delle proteine strutturali. In questo modo i virioni verranno riempiti dal genoma. Questa è detta trascrizione in due tempi. Nei virus herpetici abbiamo invece un'organizzazione temporale in tre tempi. In questo caso abbiamo i geni precoci che si distinguono in immediati precoci e nei precoci ritardati. Nell'herpes virus abbiamo cinque immediati precoci; due di questi servono per la trascrizione dei geni precoci ritardati.
Comunque la I classe, a DNA a doppio filamento, può essere ulteriormente suddivisa in due gruppi: quello in cui la replicazione del genoma è esclusivamente nucleare (come nel caso di Adenoviridae, Polyomaviridae ed Herpesviridae), e quello in cui la replicazione avviene nel citoplasma (Poxviridae). In un certo qual modo tutti questi virus possono essere considerati simili: essi sono essenzialmente trascritti con le stesse procedure dei geni cellulari, poiché i loro genomi somigliano completamente al DNA cellulare a doppio filamento. Esistono invece grosse differenze relativamente al grado di dipendenza dal macchinario della cellula ospite. Ad esempio i Poliomavirus dipendono pesantemente dal macchinario sia per la replicazione che per l'espressione genica. Uno dei virus più rappresentativi per questa famiglia è SV40, un virus nudo molto piccolo con un genoma a DNA a doppio filamento, che infetta solo le scimmie. Questo entra nella cellula grazie alla formazione di un endosoma. Successivamente il virione viene trasportato all'interno del nucleo dove avviene la spoliazione e il genoma virale si associa agli istoni cellulare. Come sappiamo l'espressione dei piccoli virus è suddivisa in una fase precoce e in una fase tardiva, in mezzo alle quali abbiamo la replicazione del DNA. In questo caso la fase precoce è rappresentata dall'espressione di due proteine: l'antigene T (grande) e l'antigene t (piccolo), due fattori trans-attivanti. L'antigene t deriva dallo stesso gene che codifica per l'antigene T, ma il cui RNA ha subito un processo di splicing alternativo e inoltre l'antigene t non risulta essere tumorigenico. Comunque l'antigene T si lega a pRB nel suo stato attivato (proteina del retinoblastoma) e alla proteina p53. La proteina Rb e' una proteina che sopprime le funzioni trans-attivatorie del fattore di trascrizione E2F il quale e' responsabile della attivazione dei promotori dei geni necessari per l'ingresso nella fase S (replicazione) del ciclo cellulare. L'attivazione di E2F avviene normalmente per fosforilazione di Rb (da parte delle Cdk4/6-ciclina D attivata dai fattori di crescita), che porta alla dissociazione Rb-E2F ed E2F diventa capace di attivare la trascrizione. L'antigene T, quindi, sottraendo Rb ad E2F porta alla sua attivazione aspecifica anche in assenza del segnale mediato dai fattori di crescita e quindi induce l'aumento della sintesi del DNA cellulare in modo tale che entri nella fase S del ciclo cellulare. In questo modo il virus prepara l'ambiente adatto per replicare il proprio genoma.  L'antigene T lega anche p53 in modo tale che p21 non inibisca la chinasi ciclina-dipendente e quindi non blocchi la replicazione. Se questo non succedesse la cellula potrebbe andare in apoptosi, questo può essere spiegato dal fatto che p53 risulti essere un segnale di stop alla replicazione. Quindi possiamo dire che, l'antigene T da una parte attiva la replicazione e dall'altra inibisce i segnali opportuni di “non replicazione”. Quando la concentrazione della proteina T aumenta, essa si lega ai siti di origine della trascrizione (ori) per iniziare la sintesi del DNA virale. Quindi si spegne la trascrizione dei geni precoci legandosi al rispettivo promotore e si attiva la trascrizione dei geni tardivi che codificano per proteine appunto tardive. Si impacchetta il genoma e vengono prodotte nuove particelle virali. In SV40 i prodotti della trascrizione sono principalmente due: un pre-mRNA precoce e un pre-mRNA tardivo, che tramite splicing danno origine a una serie di proteine. Come si può capire, questo meccanismo appena descritto avviene in tutte quelle cellule che risultano essere sia suscettibili sia permissive, come nel caso delle scimmie. In una cellula, invece, non permissiva, non si produce nuova progenie virale e si arriva fino alla trascrizione precoce che viene attivata da fattori cellulari. Quindi viene prodotto anche l'antigene T che va a sopprimere l'attività di pRB e di p53. Infine avremo una cellula con un genotipo trasformato. Il genoma virale con il tempo potrà venire perso e quindi riavremo una cellula normale oppure può integrarsi a quello della cellula ospite producendo sempre proteina T e quindi alterando il ciclo cellulare, per questo l'antigene T è risulta essere tumorigenico.
Anche Papillomavirus, è un piccolo virus tumorale con genoma a DNA a doppio filamento, che produce fenotipo trasformato quando la cellula non è permissiva e anch'esso produce l'antigene T quindi il meccanismo di replicazione ed espressione risulta essere molto simile a SV40.
Gli Adenovirus, invece, sono sempre virus tumorali con genoma a DNA a doppia elica ma la loro espressione risulta essere più complessa, in quanto possiedono numerosi meccanismi di regolazione specifica dell'espressione genica virale. Questi meccanismi comprendono attivatori trascrizionali trans-attivanti, come le proteine codificate dalla regione E1A. Questa regione contiene geni immediati precoci che producono proteine simili all'antigene T con la sua stessa funzione, ossia quella di legare pRb appena raggiunto il nucleo. E1A, oltre ad essere un trans-attivatore attivando i geni precoci e successivamente quelli tardivi (in quanto in adenovirus abbiamo una fase precoce immediata, fase precoce, avviene la replicazione, e fase tardiva), quando si attivano i geni tardivi reprime la propria funzione replicativa rispetto ai geni immediato precoci. Quindi abbiamo una regolazione sia positiva che negativa. Questo succede perché anche se il macchinario cellulare è stato infettato, la cellula ospite tende sempre a consumare la più piccola parte di energia quindi quando E1A non è più necessario conviene “spegnere” i geni che la producono.  Per quanto riguarda la replicazione del genoma virale in adenovirus, si replica a partire da entrambi le estremità, usando il meccanismo dello spostamento del filamento. Gli adenovirus, insieme agli herpesvirus, codificano la propria DNA polimerasi virale che replica più velocemente ma con più errori. Una particolare strategia di replicazione viene usata dagli adenovirus che hanno una proteina terminale (che funge da primer per la replicazione) legata al 5' di ogni filamento. La proteina preterminale, formata da tre proteine, viene legata con un legame fosfodiesterico, catalizzato dalla polimerasi virale, ad una serina presente su una molecola di DNA. Questa proteina terminale interagisce con la polimerasi virale che funge da primer per la sintesi della molecola di DNA. Il 3’OH di dCMP (serina) serve da innesco per la sintesi (in continuo) del filamento di DNA complementare. Mentre procede la sintesi di questo DNA, l'elica complementare viene dislocata e viene legata da una proteina di legame sul singolo filamento di DNA. Un'elica viene allontanata e questa, sfruttando le sequenze ripetute terminali, può associarsi e formare una struttura a manico di padella dove troviamo una condizione simile a quella iniziale, dove si può legare una DNA polimerasi e iniziare la sintesi dell'elica complementare. Alla fine del processo abbiamo due molecole di DNA; una proteasi virale leva la proteina terminale e la rende matura fino ad arrivare al genoma del virus di partenza replicato
Gli Herpesvirus, invece, risultano essere meno dipendenti dagli enzimi cellulari rispetto ai precedenti virus. Essi codificano molti enzimi coinvolti nel metabolismo del DNA e molti fattori trans-attivanti, che regolano l'espressione temporale dei geni virali controllando le fasi d'infezione. A seguito della trascrizione del genoma da parte della RNA polimerasi II cellulare vengono prodotte almeno 50 proteine virali. Gli mRNA virali vengono suddivisi in tre classi:
1.α: mRNA precoci immediati (IE), che codificano 5 regolatori della trascrizione (trans-att.);
2.β: mRNA precoci (ritardati), che codificano altre proteine regolatrici non strutturali, proteine enzimatiche e alcune proteine strutturali minori, comunque coinvolte nella replicazione del genoma;
3.γ: mRNA tardivi, che codificano le proteine strutturali maggiori ed il fattore αTIF o VP16, un fattore di trascrizione che verranno impacchettati nel genoma virale di nuova sintesi e al successivo ciclo virale verranno liberati per attivare di nuovo i geni precoci.
L'espressione genica degli herpesvirus, inoltre, è regolata in modo strettamente coordinato, infatti, se la traduzione è bloccata subito dopo l'infezione (ad esempio trattando le cellule con particolari sostanze), gli mRNA precoci si accumulano immediatamente nel nucleo e nessun altro mRNA virale viene trascritto. Inoltre la sintesi dei geni precoci spegne i prodotti precoci-immediati e dà inizio alla replicazione del genoma. Comunque nella replicazione del genoma è coinvolta una DNA polimerasi DNA-dipendente virale, insieme a un certo numero di enzimi virali che alterano la biochimica cellulare. Esiste un controllo molto stretto della produzione di tutte queste proteine.
Per quanto riguarda, invece, i Parvovirus, sono piccoli virus a DNA a singolo filamento (4,5-6kb) con capside icosaedrico nudo (18-28nm), che quindi facilmente entrano nel poro nucleare. I parvovirus sono virus che hanno ben poca informazione genetica e spesso dipendono dalla presenza di un altro virus. Sono infatti virus difettivi e satelliti di altri virus. Essi, non avendo infatti enzimi necessari per la replicazione, hanno bisogno di virus helper che facilitino la loro replicazione e trascrizione. La molecola lineare di DNA a singolo filamento è caratterizzata da avere estremità abbastanza lunghe di sequenze palindromiche (115nt) che permettono a questa molecola di assumere una forma ripiegata fondamentale affinché questa venga trasformata in molecola a doppio filamento. Questo DNA può essere trascritto in proteine precoci e tardive. Le proteine precoci non strutturali (gene NS1 e rep) vengono espresse sia usando splicing alternativi che ORF differenti mentre le proteine che formano il capside virale (generalmente 2-3, geni cap) vengono espresse solo a partire da ORF differenti. I parvovirus hanno sequenze terminali (LTR) ripetute che gli fanno assumere una forma ad hairpin. La loro replicazione segue infatti il rolling hairpin model. Appena il DNA entra, una molecola complementare di DNA viene sintetizzata ad opera della DNA pol cellulare usando come primer l'hairpin che si forma. Una proteina codificata dal virus, rep78, taglia il terminale (hairpin) permettendo la sintesi di tutta la molecola di DNA da cui si separano i genomi figli.