Test di fluttuazione e replica plating

I due esperimenti fondamentali che hanno permesso di arrivare a questa conclusione sono il test di fluttuazione di Salvatore Luria e Max Delbruck e il replica plating di Esther e Joshua Lederberg. I primi ricorrendo all'analisi della fluttuazione del numero di mutanti di E.coli resistenti al fago T1, dimostrarono che le variazioni osservate nei batteri rappresentavano effettivamente delle mutazioni che insorgevano spontaneamente in coltura, in assenza di induzione da parte di fattori esterni, confutando in tal modo la teoria adattativa. Analizziamo in dettaglio l'esperimento. Batteri provenienti da una coltura di E.coli, originata da una singola cellula sensibile al fago T1, vengono inoculati contemporaneamente in una beuta e in diverse provette contenenti terreno nutritivo. Ogni inoculo è costituito da un numero basso di batteri (50-500), in modo di avere una probabilità molto alta di non avere mutanti resistenti al fago. Quando si è raggiunta la crescita massima nelle colture, si semina un aliquota dei batteri di ogni coltura in provetta su una piastra, contemporaneamente a un numero di fagi da poter uccidere tutte le cellule sensibili. Analogamente aliquote di batteri vengono prelevate dalla beuta e seminate su diverse piastre insieme ai batteriofagi. Le piastre vengono poi inoculate per permettere l'uccisione delle cellule sensibili e la formazione di colonie da parte delle eventuali cellule resistenti. Se i mutanti si originassero in seguito al contatto con il fago (teoria adattativa), dato che in ogni piastra è stato seminato un egual numero di batteri ci si aspetterebbe per tutte le piastre un identico numero di colonie (con variazioni minime). Se invece le mutazioni avvenissero a caso durante la crescita in coltura, prima cioè che le cellule vengano esposte in coltura (teoria genica), il numero di mutanti resistenti atteso per ogni provetta dovrebbe dipendere dal momento della comparsa del primo mutante e quindi fluttuare: prima avviene la mutazione durante la crescita, e più numerosi saranno i batteri resistenti alla fine della crescita. I risultati mostrarono che vi è effettivamente una grande fluttuazione nel numero delle colonie nelle piastre dove sono state seminate le colture indipendenti: infatti in alcune piastre le colonie sono assenti, in alcune sono pochissime e in altre più numerose.  
Una prova più diretta sull'origine della mutazione in E.coli fu ottenuta, con la tecnica del replica plating, da Joshua e Esther Lederberg. Per l'isolamento di mutanti biochimici si fa un inoculo in una piastra di terreno completo; poi, per verificare se i batteri di ciascuna colonia siano capaci di replicarsi su terreni diversi, privati alternativamente di specifici nutrienti, occorre trasferire una frazione di ogni colonia nelle piastre con i vari terreni da provare. Ciò può essere eseguito con un ansa sterile, seminando cellule provenienti da ciascuna delle colonie presenti nella piastra originaria (piastra madre); in alternativa si può utilizzare un tampone di velluto, su cui rimangono adese alcune cellule di ciascuna colonia, premendo successivamente il tampone sulle piastre con i vari terreni selettivi.