L'ibridazione in situ fluorescente - Fish

Una tecnica attualmente molto utilizzata è l'ibridazione in situ fluorescente (FISH, Fluorescence In Situ Hybridization), un tipo particolare di ibridazione in situ che impiega sonde la cui presenza può essere segnalata mediante marcatura con molecole fluorescenti. Il principio su cui si basa questa tecnica è quello per cui una qualunque sequenza di DNA è capace di legarsi alla sua sequenza complementare in un DNA denaturato. Una volta che questa sequenza, chiamata sonda (probe), sia stata opportunamente marcata, essa diventerà evidenziabile. Per la marcatura della sonda vengono utilizzate due diverse procedure:
1.Una marcatura diretta, in cui si forma un legame covalente tra i nucleotidi della sonda e un colore fluorescente (fluorocromo); laddove nei cromosomi di una cellula avviene l'ibridazione tra la sonda fluorescente e la sequenza bersaglio, è visibile sul preparato un segnale fluorescente immediatamente rilevabile mediante un microscopio a fluorescenza;
2.Una marcatura indiretta, in cui le sonde vengono marcate con molecole non fluorescenti, come la biotina (una vitamina) o la digossigenina (uno steroide di origine vegetale), che si legano covalentemente a un nucleotide della sonda. Per identificare la presenza della sonda ibridata il preparato è trattato con molecole coniugate con un fluorocromo che presenta elevata affinità con la biotina e la diossigenina.
Le applicazioni più importanti della FISH sono: l'identificazione di anomalie strutturali costitutive dei cromosomi ad alto potere di risoluzione, una rapida identificazione di cromosomi umani in ibridi di cellule somatiche, l'identificazione di cromosomi marcatori e di riarrangiamenti complessi in preparati metafasici da tumori, il mappaggio di geni/sequenza e l'analisi di aberrazioni cromosomiche indotte da radiazioni o mutageni. Comunque, altre tecniche che fanno uso della FISH sono l'ibridazione genomica comparativa, tecnica che permette di valutare e localizzare le differenze quantitative di regioni di DNA fra due diversi genomi, ad esempio una linea tumorale o trattata rispetto a una popolazione cellulare normale, e il cariotipo a più colori (SKY, Multicolor Spectral Karyotyping), tecnica che ha permesso l'analisi contemporanea di tutti i cromosomi identificati da uno specifico spettro di emissione che viene poi convertito digitalmente in un colore diverso per ogni singolo cromosoma.