L'ibridazione - southern, northern e western blot

Il fenomeno dell'ibridazione, ossia la capacità di una molecola di acido nucleico a singolo filamento di formare una doppia elica con un'altra sequenza composta di basi a essa complementari, rappresenta uno dei punti di partenza fondamentali della moderna biologia molecolare. Molti dei geni eucariotici fanno parte di famiglie geniche strettamente correlate. In che modo potremmo determinare il numero dei membri di una particolare famiglia genica? Si comincia utilizzando un enzima di restrizione per tagliare il DNA genomico isolato da un organismo. È meglio utilizzare un enzima di restrizione come EcoRI che riconosce una sequenza di 6 bp come sito di taglio. Questo enzima produrrà migliaia di frammenti di DNA genomico, di dimensioni medie di 4000 bp circa. Successivamente, questi frammenti vengono sottoposti a elettroforesi su gel di agarosio. Il risultato, se le bande vengono visualizzate per colorazione, sarà una striscia composta da migliaia di bande, indistinguibili l'una dall'altra. Eventualmente, si potrà, per questo motivo, far avvenire l'ibridazione tra una sonda radioattiva e queste bande per scoprire quante di queste contengono la sequenza codificante il gene d'interesse. Edward Southern è stato un pioniere di questa tecnica; egli trasferì i frammenti di DNA da un gel di agarosio a un filtro di nitrocellulosa per diffusione. Questo procedimento è stato quindi da allora chiamato Southern blotting. Oggi, il blotting viene frequentemente ottenuto sottoponendo a elettroforesi le bande di DNA fino a farle uscire dal gel per farle approdare al blot. Prima di essere trasferiti, i frammenti di DNA vengono denaturati con una soluzione basica in modo che il risultante DNA a singolo filamento possa legarsi alla nitrocellulosa, dando così il Southern blot. In seguito, il DNA clonato viene marcato aggiungendo DNA polimerasi in presenza di precursori di DNA marcati. Quindi, questa sonda radioattiva viene denaturata e fatta ibridare con il Southern blot. Ovunque la sonda incontrerà sul filtro una sequenza di DNA complementare, si appaierà a essa formando una banda marcata corrispondente al frammento di DNA che contiene il gene d'interesse. Infine, queste bande vengono visualizzate per autoradiografia con una pellicola a raggi X. A questo punto, se dovesse essere visibile una sola banda, l'interpretazione sarebbe relativamente semplice; probabilmente solo un gene possiede una sequenza complementare a quella utilizzata come sonda di cDNA. Se invece, sono presenti più bande, sono probabilmente presenti più geni che contengono la sequenza di interesse, ma potrebbe risultare difficile dire quanti. Per minimizzare questo problema spesso si utilizza una sonda corta ottenuta sempre per restrizione del cDNA.
Se, invece, supponiamo di aver clonato un cDNA (un DNA copia di un RNA)  di voler sapere quanto attivamente il gene corrispondente (un gene X) sia espresso in un numero differente di tessuti in un organismo Y, si può cominciare raccogliendo RNA da vari tessuti dell'organismo in questione. Poi, si sottopongono questi RNA a una elettroforesi su gel di agarosio e si trasferiscono su un supporto opportuno. Poiché il procedimento simile per il DNA è denominato Southern blot, è venuto naturale chiamare un blot di RNA con il nome di Northern blot (per analogia, un blot di proteine è chiamato Western blot, e si utilizzano anticorpi per legare le proteine ). Successivamente si può ibridare il Northern blot con una sonda di cDNA marcata radioattivamente. Ovunque sul blot esista un mRNA complementare alla sonda avverrà l'ibridazione risultando in bande che si possono visualizzare con una pellicola ai raggi X. Se, accanto agli RNA estratti si fanno correre per elettroforesi anche dei marcatori di RNA di dimensioni note, è possibile determinare le dimensioni delle bande di RNA che compaiono in seguito all'ibridazione con sonda radioattiva. Inoltre, il Northern blot fornisce informazioni riguardanti l'abbondanza del trascritto del gene X. Maggiore è la quantità di RNA contenuta nella banda, maggiore sarà la quantità di sonda radioattiva che si appaierà a essa, tanto più scura diventerà la banda ai raggi X.